三妙丸类方及川牛膝对急性痛风性关节炎大鼠炎症反应的作用机制研究

单 玮 阙华发

(上海中医药大学附属龙华医院中医外科，上海，200032)

流行病学研究发现，痛风已成为一种遍布全球的多发病、常见病，在我国痛风是仅次于糖尿病的代谢病，对患者的生命健康，生活质量的危害较大［1－2］。目前国内外尚无根治痛风的办法。现今治疗痛风的目的是控制痛风性关节炎急性发作、降低血清尿酸水平，以预防尿酸盐沉积导致的关节破坏及肾脏损害。对急性痛风性关节炎的处理，西医首选的药物仍然是秋水仙碱与非甾体类解热镇痛药，这两类药物具有起效快，疗效显著的特点，但其严重的毒副反应限制了临床运用。中医药治疗痛风性关节炎具有临床疗效肯定，毒副反应小，可以长期服用的特点，在痛风性关节炎的防治方面具有西医西药不可替代的优势。痛风性关节炎属于中医“湿热痹”范畴，病机关键在于湿热痹注，临床治疗采用清热祛湿，解毒消肿，化瘀止痛为大法。金元时期的朱丹溪，创制上中下通用痛风方，用苍术、黄柏(二妙散)为基本组方治之，其治法对后世启迪深远。现代临床多用二妙丸加川牛膝组成的三妙丸为基础，治疗痛风性关节炎取得良好疗效。为了探讨三妙丸类方与引经药川牛膝在调控痛风性关节炎中的作用机理，我们进行了以下实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SPF 级Wistar 大鼠70只，2月龄，体质量180～220 g，平均(203.00±10.73)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(SCXK(沪)2007－0005)。饲养于上海中医药大学附属龙华医院动物实验中心，在18～28℃，相对湿度40%～70%的屏障系统喂养，正常饲料和饮水，分笼饲养，每笼5只。

1.1.2 实验药物及试剂 中药饮片:川牛膝、苍术、黄柏，均由龙华医院中药房提供并制成水煎剂。其中二妙丸组由苍术30 g、黄柏20 g组成，减压浓缩至含生药0.5 g/mL，人鼠等效剂量为4.41 g/kg;三妙丸低剂量组由苍术30 g、黄柏20 g、川牛膝10 g组成，减压浓缩至含生药1.08 g/mL，人鼠等效剂量为5.29 g/kg;三妙丸高剂量组由苍术30 g、黄柏20 g、川牛膝30 g组成，减压浓缩至含生药1.44 g/mL，人鼠等效剂量为7.05 g/kg;川牛膝低剂量组由川牛膝10 g组成，减压浓缩至含生药0.18 g/mL，人鼠等效剂量为0.89 g/kg;川牛膝高剂量组由川牛膝30 g组成，减压浓缩至含生药0.54 g/mL，人鼠等效剂量为2.64 g/kg。尿酸钠结晶:美国Sigma－Aldrich 公司提供，批号:BCBC2022。

1.2 方法

1.2.1 痛风性关节炎动物模型建立 参照文献方法［3－4］，将1 g 尿酸钠结晶加入40 mL 生理盐水，再加10 mL 吐温80，加温搅拌，制成浓度为20 mg/mL的尿酸钠溶液。用4.5号注射针在大鼠右侧踝关节背侧从45°方向插入右侧胫骨肌键内侧，将50μL 尿酸钠溶液注入到右侧踝关节腔，形成痛风性关节炎大鼠模型。

1.2.2 动物分组 70只大鼠随机取10只作为正常组，其余60只大鼠建立模型后随机分为模型组、二妙丸组、三妙丸低剂量组、三妙丸高剂量组、川牛膝低剂量组、川牛膝高剂量组，每组10只。

1.2.3 给药方法 各组于造模后次日开始给药，正常组和模型组予生理盐水灌胃每日1次，每次2 mL;各药物干预组分别予相应的中药煎剂灌胃每日1次，每次2 mL。

2 观察指标

2.1 急性痛风性关节炎大鼠右踝关节肿胀度 用容积法测定大鼠踝关节的周径［5］。试验前在每只大鼠右侧踝关节处作标记，按容积法测定各鼠右侧足踝容积2次，取2次的容积平均值作为各鼠造模前容积，确保各组数据无统计学意义。造模后6 h、24 h、48 h、72 h用上述方法测量各组大鼠右足踝容积，取平均值作为记录数据。

2.2 急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织NF－κB P65 表达水平、TNF－α、IL－6、IL－8的水平 用药3天后，各组大鼠以盐酸氯胺酮(100 mg/Kg)麻醉，剪下大鼠右侧踝关节，取大鼠右踝关节滑膜组织，放入冻存管内，分别粘贴标记，用ELISA 法检测TNF－α、IL－6、IL－8的水平，用Western blot 法检测NF－κB P65 表达水平。

2.3 急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织的形态学检查 取大鼠滑膜组织放入清洁EP 管，10%福尔马林浸泡，固定保存，作组织病理用。急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织进行镜下组织形态学检查，评分标准根据文献改良［6－7］。1)血管充血:正常0分;轻度1分;中度2分;重度3分;2)炎细胞浸润:正常0分;轻度1分;中度2分;重度3分;3)滑膜肿胀:正常0分;轻度1分;中度2分;重度3分;4)组织坏死:正常0分;轻度1分;中度2分;重度3分。

3 统计学方法

用SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析，数据均用均数±标准差表示。采用重复测量数据的方差分析和单因素方差分析，多组均数间的两两比较采用LSD－T 检验。

4 结果

4.1 急性痛风性关节炎大鼠右踝关节肿胀度 与正常组比较，模型组大鼠右踝关节肿胀度明显高于正常组(P＜0.01)，说明模型复制成功;造模后72 h，与模型组比较，各药物干预组大鼠右踝关节肿胀度低于模型组(P＜0.01，P＜0.05);其中，三妙丸高剂量组大鼠右踝关节肿胀度低于二妙丸组、川牛膝组、三妙丸低剂量组(P＜0.01);二妙丸组大鼠右踝关节肿胀度低于川牛膝组(P＜0.01)。造模后，除正常组大鼠外，其余各组大鼠出现明显踝关节肿胀，于造模后6 h 出现炎症反应，24 h 达到最高峰，48～72 h 有所减轻，见表1、图1。

表1 各组大鼠右踝关节肿胀度测定结果

图1 各组大鼠踝关节肿胀度测定结果

4.2 急性痛风性关节炎大鼠右踝关节滑膜组织NF－κB P65 蛋白表达水平 与正常组比较，模型组NF－κB P65 表达水平明显高于正常组(P＜0.01);与模型组比较，各药物干预组NF－κB P65 表达水平明显降低(P＜0.01);其中三妙丸高剂量组NF－κB P65 表达水平低于二妙丸组、三妙丸低剂量组、川牛膝低剂量组、川牛膝高剂量组(P＜0.01);二妙丸组NF－κB P65 表达水平低于川牛膝低剂量组、川牛膝高剂量组(P＜0.01);川牛膝低剂量组与川牛膝高剂量组组间比较(P＞0.05)，见表2、图2。

表2 各组大鼠踝关节滑膜组织NF－κB P65 Western blot 法检测结果

图2 各组大鼠踝关节滑膜组织NF－κB P65 Western blot 法检测结果

4.3 急性痛风性关节炎大鼠右踝关节滑膜组织TNF－α，IL－6，IL－8的水平 与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织TNF－α、IL－6、IL－8水平明显高于正常组(P＜0.01);各药物干预组滑膜组织TNF－α、IL－6、IL－8水平低于模型组(P＜0.01);其中三妙丸高剂量组滑膜组织TNF－α 水平低于二妙丸组、三妙丸低剂量组、川牛膝低剂量组、川牛膝高剂量组(P＜0.01);三妙丸低剂量组与三妙丸高剂量组滑膜组织IL－6、IL－8水平低于二妙丸组、川牛膝低剂量组、川牛膝高剂量组(P＜0.01)，三妙丸低剂量组与三妙丸高剂量组组间比较(P＞0.05);二妙丸组滑膜组织TNF－α、IL－6、IL－8水平低于川牛膝低剂量组、川牛膝高剂量组(P＜0.01);川牛膝低剂量组与川牛膝高剂量组组间比较(P＞0.05)，见表3。

表3 各组大鼠滑膜组织TNF－α、IL－6、IL－8检测结果

表4 各组大鼠踝关节组织病理学积分

4.4 急性痛风性关节炎大鼠右踝关节滑膜组织病理学形态组织病理学观察:光镜下观察可见正常滑膜光滑而有光泽，半透明，滑膜由2～4 层上皮样结缔组织细胞构成，无基膜，细胞间有少量结缔组织和纤维，滑膜组织无炎性细胞浸润、滑膜细胞增生和毛细血管充血、水肿;模型组滑膜充血、水肿，炎细胞浸润，滑膜细胞增生;与正常组比较，模型组滑膜组织病理学积分高于正常组(P＜0.01);与模型组比较，各药物干预组滑膜组织病理学积分低于模型组(P＜0.05);其中川牛膝高剂量组滑膜组织病理学积分低于二妙丸组、三妙丸组、川牛膝低剂量组(P＜0.05)，见表4、图3、图4、图5。

图3 正常组大鼠滑膜组织形态(×100)

图4 模型组大鼠滑膜组织形态(×100)

图5 川牛膝高剂量组大鼠滑膜组织形态(×100)

5 讨论

急性痛风性关节炎属于中医“湿热痹”范畴，其发病以脾肾两虚为本，湿浊、痰瘀、热毒为标，属正虚邪实之证［8－12］。病位属下部，病机关键在于湿热痹注。针对湿、热、痹为痛风性关节炎发病的关键因素，临床治疗采用清热祛湿，解毒消肿，化瘀止痛为法，常用清热祛湿的三妙丸类方加减治疗，取得显著的疗效。三妙丸出自明代虞抟所著的《医学正传》，是由《丹溪心法》二妙丸加牛膝而成。方中苍术燥湿健脾、祛风湿;黄柏清热燥湿、泻火解毒;牛膝活血通经、补肝肾、强筋骨、利水通淋、引药下行［13－15］;三药合用，共奏清热活血利湿之功。

实验结果显示:在模型建立后6h、24h、48h、72h，各药物干预组大鼠踝关节肿胀度均明显低于模型组(P＜0.01 或P＜0.05)，说明二妙丸、三妙丸、川牛膝具有降低急性痛风性关节炎大鼠关节肿胀度的作用;其中三妙丸降低急性痛风性关节炎大鼠关节肿胀度的疗效尤为显著，其理论基础在于三妙丸是在二妙丸的基础上加入川牛膝而成，川牛膝除了具有化瘀通络、补益肝肾功效外，还有“引药下行”的作用。《寒温条辨》记载“牛膝，生用其性下走如奔，破血症，通经闭，引诸药下行”;《本经逢原》亦云“丹溪言牛膝能引诸药下行，筋骨痛风在下者宜之。”因此，在二妙丸中加入引经药川牛膝可以加强二妙丸的药效。在抑制踝关节肿胀度方面，二妙丸与川牛膝具有药效的协同及增效作用。实验结果显示随着三妙丸中牛膝剂量的增加，其抑制踝关节肿胀度的作用增强，具有一定的量效正相关关系。

现代医学认为，痛风性关节炎急性发作是尿酸钠盐结晶在关节及关节周围结缔组织以结晶形式沉积引起的急性炎症反应，是PMN 介导的炎症。目前研究发现，NF－κB 是急性炎症反应的中枢环节，NF－κB的不适当激活是引起过度炎症反应和炎症损伤的关键因素。活化的NF－κB 可高效诱导多种细胞因子，如TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8、粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子等。同时，对参与炎症反应放大与延续(即级联瀑布效应)的多种酶的基因表达具有重要的调控作用。TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8作为炎症趋化因子和激活因子，在痛风性关节炎的发生、发展过程中起重要作用［16］，它们与疾病的进程及预后密切相关［17－18］。阻断NF－κB 活性，从而下调众多的炎性细胞因子表达成为目前预防、治疗痛风性关节炎的希望和策略。实验结果显示:模型组NF－κB P65 表达水平明显高于正常组，说明大鼠致炎后在局部组织有高表达的NF－κB P65 存在，NF－κB P65 参与了炎症反应;各药物干预组NF－κB P65 表达水平低于模型组(P＜0.01)，说明二妙丸、三妙丸、川牛膝通过下调NF－κB P65 表达水平，抑制NF－κB 活性，减轻局部炎症，发挥抗炎作用。其中三妙丸下调NF－κB P65 表达水平尤为显著，并且随着三妙丸中牛膝剂量的增加，其下调NF－κB P65 表达水平的作用增强。三妙丸抗炎作用的增强，机制可能在于在二妙丸中加入牛膝后，增强了二妙丸的抑制NF－κB 活性的作用。通过对滑膜组织细胞因子的检测，发现二妙丸、三妙丸、川牛膝具有降低滑膜组织的IL－6、IL－8、TNF－α 水平的作用，并且随着三妙丸中引经药川牛膝剂量的增加，其抑制细胞因子的作用增强;说明在引经药牛膝的协同作用下，可以加强二妙丸抑制细胞因子的作用。

尿酸钠盐沉积是痛风性关节炎的特征性病理改变，病变主要发生在关节软骨、滑膜、关节周围软组织等部位。可以看到滑膜组织炎细胞浸润，尿酸钠盐沉积、组织局部坏死，间质胶原纤维样变性，增生性变化，肉芽肿。本实验在光镜下观察到，正常滑膜光滑而有光泽，半透明，滑膜组织无炎性细胞浸润、细胞增生和毛细血管充血、水肿;模型组滑膜充血、水肿，炎细胞浸润，滑膜细胞增生;二妙丸、三妙丸、川牛膝对滑膜炎症反应较模型组均有不同程度减轻，以川牛膝高剂量组改善滑膜组织病理损害的作用尤为明显。其理论基础可能与牛膝具有补益肝肾、活血痛经的作用有关。

本研究结果为三妙丸类方及引经药川牛膝治疗急性痛风性关节炎提供了科学的依据，为中药的引经研究提供新思路，对开发中药靶向给药体系奠定基础。

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