中医解毒法优化干预对BALB/c结肠癌小鼠CEA、sCD44的实验研究

阮善明 沈敏鹤 王 益 林 红 郑丽萍 李梦婷 张 恺

(1 浙江中医药大学附属第一医院肿瘤中心，杭州，310006;2 浙江中医药大学，杭州，310053)

本研究解毒法的代表方剂解毒三根汤源于本院70年代初期创制的解毒抗癌验方三根糖浆，其主要组成为虎杖根、藤梨根、水杨梅根，临床实践已经证明解毒三根汤治疗消化道肿瘤的有效性;同时以消化道一线化疗药5－FU 作为化疗法的代表［1－2］。本实验通过建立CT－26结肠癌细胞小鼠移植瘤模型，以解毒三根汤联合传统化疗药5－FU 从不同阶段干预实验模型，以抑瘤率、体重等为主要观察目的，评价中医解毒法联合化疗的优化治疗模式。同时，通过ELISA 法检测血清CEA、sCD44 含量，进一步探讨其治疗结肠癌的可能作用机制，现结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞 CT26结肠癌细胞系由浙江中医药大学提供。

1.1.2 实验动物 SPF 级健康BALB/C 小鼠，60只，体重(18±2)g，6～8周龄，雄性。购自浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.1.3 实验药品 氟尿嘧啶粉剂购自上海源叶生物科技有限公司。解毒三根汤(藤梨根30 g、虎杖根30 g、水杨梅根30 g)，购自浙江省中医院中药房，按照原方比例配置成解毒法汤煎剂，过滤浓缩后每毫升含生药1.2 g。(藤梨根:产地浙江，批号:20101117;水杨梅根:产地浙江，批号:20101210;虎杖根:产地浙江，批号:20090302)。解毒三根汤水煎剂的制备:由生药材藤梨根500 g，水杨梅根500 g，虎杖根500 g，共1500 g。先用10 倍生药重量的蒸馏水浸泡半小时，武火煎沸后改文火煎半小时，用8 层纱布过滤取出药汁，再加入8倍水，文火煎半小时，过滤取汁，收集两次煎剂，弃去药渣，文火浓缩成1.2 g/mL，分装至无菌玻璃瓶内，并沸水浴内煮半小时，冷却后4℃冰箱冷藏。

1.1.4 实验主要试剂 胎牛血清(FBS):Gibco 公司;RPMI Medium 1640:Gibco 公司;PBS:杭州科易生物技术有限公司;胰蛋白酶(0.25%胰酶+0.02%EDTA):杭州吉诺生物医药技术有限公司;二甲基亚砜(DMSO):Amersco 公司;小鼠CEA ELISA 试剂盒:杭州达文生物科技有限公司，R＆D 公司进口分装;小鼠sCD44 ELISA 试剂盒:杭州达文生物科技有限公司，R＆D 公司进口分装。

1.1.5 实验仪器 自动平衡离心机LDZ5－2:北京医用离心机厂;5%CO2培养箱HEPA class100:Thermo 公司;倒置显微镜:Olympus 公司;生物安全柜:Thermo 公司;电热恒温水浴器DK－S24型:上海森信公司;电子天平:浙江凯丰集团有限公司;液氮储存罐:Thermo 公司;超低温冰箱:日本SANYO 公司;移液器:Eppendrof公司。

1.1.6 试剂配制 工作溶液的配制:将50 体积BCA Reagent 与1 体积Cu Reagent 混合即为WR 工作试剂，呈嫩绿色;室温1周内稳定。标准蛋白溶液配制:用PBS 与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释:20μL 4 000μg/mL BSA+30μL 稀释溶液(PBS)=50μL(BSA=1 600μg/mL)，从中取25μL 连续倍比稀释，得到BSA 标准溶液1 600、800、400、200、100、50、25、0(仅PBS)μg/mL，各25μL。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物选择与分组 健康BALB/C 小鼠60只，体重18±2 g，雄性，称重后随机分成5组移植瘤模型:提前干预组、延后干预组、单纯中药组、单纯化疗组、模型对照组以及1组阴性对照组，每组10只。各组小鼠分笼饲养，每笼5只。治疗期间定期监测体重及瘤体变化。

1.2.2 动物造模 将小鼠适应性饲养1周，正常饮食。取50只小鼠右腋皮下接种CT26结肠癌细胞建立移植瘤模型。取CT26结肠癌细胞株复苏后培养传代，收集对数生长期细胞，以生理盐水调整细胞浓度至1×107/mL，每鼠接种0.2 mL 于右侧腋下皮下。

1.2.3 动物给药 接种当天记为第0 d，提前干预组:接种后第1～7 d 中药灌胃，第8～14 d 予5－FU 腹腔注射。延后干预组:于接种第8～14 d 予5－FU 腹腔注射，第15～21 d 中药灌胃。单纯化疗组:于接种第8～14 d 予5－FU 腹腔注射。单纯中药组:于接种第8～14 d 予中药灌胃。模型对照组:于接种第8～14 d予生理盐水灌胃。阴性对照组:不作任何处理。中药灌胃按解毒三根汤拟定剂量水煎剂定时灌胃，浓度1.2 g/mL，剂量0.2 mL/(10g·d)，每日1次。5－FU腹腔注射用0.9% 生理盐水稀释成1.5 mg/mL，0.1 mL/(10g·d)，每日1次。

1.2.4 血清收集方法 实验第22 d，制备标本的60只小鼠末次灌胃(禁食不禁水12 h)4 h，摘眼球取血，常温静置15～30 min 后低温离心(3 000 r/min，15 min)，超净台上用移液枪取上层血清，－20℃冻存备用。

1.2.5 小鼠取瘤 将摘眼球取血后的荷瘤小鼠置于冰上迅速剥除右腋皮下瘤体，生理盐水冲洗后，一半用10%福尔马林固定，用做免疫组化，另一半放入冻存管暂时保存于液氮中，然后移至－70℃冰箱冻存标本。

1.2.6 细胞培养 选用CT26结肠癌细胞株，使用添加10%胎牛血清的GIBCO 公司的RPMI－1640 培养液，培养于含5%CO2的饱和湿度、37℃恒温培养箱中。所有细胞每2 d 以1:3 传代。

1.2.7 观察指标与检测方法 抑瘤率的计算:1)肿瘤体积(Volume)=a×b2/2(a 为长径，b 为短径)，体积抑瘤率(%)=1－(受试药物组平均体积÷模型对照组平均体积)×100%。2)质量抑瘤率(%)=1－(受试药物组平均瘤重÷ 模型对照组平均瘤重)×100%。ELISA 测定血清CEA、sCD44的含量。

2 结果

2.1 腋下接种CT26 细胞的BALB/c 小鼠移植瘤模型实验结果 课题组建立的是BALB/c 小鼠腋下接种CT26的小鼠移植瘤动物模型。当接种到BALB/c 小鼠右腋皮下时，发现100%成瘤，而且生长速度快，右腋皮下接种CT－26 细胞5天后，开始可以触及到米粒大小的肿块，7 d 后肿瘤长至0.5 cm3大小，造模成功。

2.2 各组小鼠的体重变化情况的观察结果 按照7 d为1个治疗阶段，取每一阶段的1、3、5、7 d 称取小鼠体重。

体重变化:图1 显示的是各组小鼠自造模成功之日起至实验结束时体重变化曲线。用药前小鼠总体体重为(18.46±1.04)g，组间无差异。治疗结束后，各组体重由高到低依次为:单纯中药组、模型对照组、提前干预组、延后干预组、单纯化疗组。提前干预组和单纯中药组跟模型对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);延后干预组、单纯化疗组与模型对照组相比体重下降明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。去瘤体重变化:图2 清晰显示了各组小鼠治疗前后的去瘤体重变化。图中显示:提前干预组和单纯中药组在治疗后体重有所上升，和模型对照组的去瘤体重相比有统计学意义(P＜0.05)，延后干预组体重变化相差不明显。

图1 各组小鼠于造模过程中的体重变化()(单位:g)

表1 各组治疗后体质量比较()(单位:g)

表1 各组治疗后体质量比较()(单位:g)

注:与模型对照组相比，* P＜0.05。

图2 各组小鼠治疗前后的去瘤体重变化()(单位:g)

2.3 实验小鼠瘤体变化以及抑瘤率观察结果 各组小鼠皮下接种细胞5 d 后，肿瘤开始可以触及，1周后可以被游标卡尺测量。分别取第二、第三阶段的1、3、5、7 d 测量肿瘤的长径以及短径，根据公式计算瘤体体积。

瘤体体积变化:小鼠瘤体体积从可以被测量起组间无统计学意义。治疗结束时，各治疗组的移植瘤从大到小依次为:模型对照组、单纯中药组、单纯化疗组、延后干预组、提前干预组。单药化疗组、单纯中药组与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);而两药合用组的抑制效果更好，提前干预组、延后干预组与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.001)。

图3 各组小鼠于造模过程中的体积变化()(单位:mm3)

治疗各组瘤体体积抑制率以及质量抑制率结果:治疗组的体积抑瘤率和质量抑制率表现出一致性，从高到低分别为提前干预组、延后干预组、单纯化疗组、单纯中药组。

表2 各组小鼠于造模过程中的瘤体体积变化()，(单位:mm3)

表2 各组小鼠于造模过程中的瘤体体积变化()，(单位:mm3)

注:与提前干预组相比，▼P＜0.05;与模型对照组相比，◇P＜0.05;与模型对照组相比，▽P＜0.05;与模型对照组相比，#P＜0.05;与模型对照组相比，* P＜0.05;与模型对照组相比，☆P＜0.05。

表3 各组小鼠体积和质量抑瘤率

图4 各组小鼠体积抑瘤率和质量抑瘤率

表4 各组小鼠血清CEA、CD44 水平情况的比较()(单位:ng/mL)

表4 各组小鼠血清CEA、CD44 水平情况的比较()(单位:ng/mL)

注:与模型对照组相比，▲P＜0.05;与模型对照组相比，■P＜0.05;与阴性对照组相比，●P＜0.05;与阴性对照组相比，□P＜0.05。

2.4 实验小鼠血清CEA及sCD44 指标的变化 实验结果显示，治疗各组血清CEA 含量均高于阴性对照组，低于模型对照组。提前干预组、延后干预组、单纯化疗组与模型组相比较，CEA 水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，单纯中药组和模型对照组之间无统计学意义。同时，实验各组的血清sCD44 含量均高于空白组，低于模型对照组。以提前干预组、延后干预组最低，其次是单纯中药组，再次为单纯化疗组，其中提前干预组、延后干预组、单纯化疗组与模型对照组相比较，sCD44 水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。单纯中药组和模型对照组之间无统计学意义。

图5 各组小鼠血清CEA、sCD44 水平

3 讨论

近年来化疗药物与植物药联用增强其抗肿瘤效果成为研究者关注的热点［3－5］，但是目前国内外对中医药在化疗期间介入时机的选择中，尚未有明确的规范化方案［6－7］。本课题在治疗期间通过对小鼠体重的观察发现，提前干预组和模型对照组的体重差异出现最早，结合瘤体体积变化，得出该体重差异的出现得益于提前干预组瘤体生长相对缓慢。同时对治疗前后小鼠的去瘤体重变化进行观察，结果显示:提前干预组以及单纯中药干预组能增加治疗后小鼠去瘤体重，且和模型对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。而延后干预组与单纯化疗组治疗后小鼠体重均有不同程度下降。解毒类中药提前干预能缓解化疗带来的毒副反应，缓解化疗对体重的负面影响。单纯解毒类中药干预小鼠，也能使小鼠体重增加，说明解毒类中药在机体未出现恶病质的情况下能有效延缓疾病的进程，缓解恶化，这可能与抑制肿瘤活性，减少肿瘤消耗有关。在对瘤体生长情况的观察中发现，小鼠瘤体体积治疗前无统计学意义，从第8天起提前组与模型组首先出现差异，并且差异有统计学意义(P＜0.05)。说明解毒三根汤能延缓小鼠瘤体生长速度。此后各组与模型组的瘤体体积差异逐渐明显。在用药期间，两药合用组显示了比单药处理组更小的瘤体变化幅度;而在两药合用组中，又以提前组显示出了良好的肿瘤抑制作用。这可能与中药的增加化疗敏感性、较少早期荷瘤有关。综上所述，化疗前应用解毒法或者当化疗未实施的情况下单独使用解毒法不仅能改善生活质量，延缓肿瘤生长速度，更能延长总生存期。化疗后应用解毒法未能在生活质量以及生存期上获得明显收益。

CD44 是分布极广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，是细胞外的基质－透明质酸的主要受体，参与细胞与细胞之间及细胞与基质之间的黏附［8］。高表达CD44分子的肿瘤细胞通过与细胞外基质中透明质酸、血管内皮细胞的黏着，赋予肿瘤细胞很强的侵袭转移能力［9－11］。血清中可溶性CD44(sCD44)来源于细胞表面CD44 胞外段的脱落，其机制可能是内生蛋白酶的作用［12］。本实验研究表明，经解毒三根汤和5－FU 治疗的小鼠血清sCD44 水平均有不同程度降低，而又以两药合用组其下降幅度最大。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是公认的消化道恶性肿瘤早期诊断的灵敏指标，同时也是观察消化道恶性肿瘤手术及放化疗效果的有用指标，已经在临床上广泛应用［13－15］。本实验发现各治疗组的CEA 水平均有不同程度下降，尤其以两药和用组明显，其效果好于单药叠加，说明中药与化疗药有协同降肿瘤标记物作用，间接提示两药合用能减少侵袭转移，提高预后。

本实验通过建立CT－26结肠癌细胞Balb/c 小鼠皮下接种模型，探索中医解毒法协同化疗治疗结肠癌小鼠的优化模式，设立两个优化治疗组解毒法提前干预组和延后干预组，同时设立单纯解毒法治疗组、单纯化疗治疗组和模型对照组，以及阴性对照组。观察解毒法优化治疗模式对小鼠体重、肿瘤病灶的影响，并对可能的作用机制进行研究。结果发现提前干预组和单纯中药组能明显增加小鼠体重，解毒法联合化疗能明显缩小病灶。同时发现中医解毒法协同化疗能下调血清sCD44 表达，表明解毒法联合化疗在缩小病灶上的获益与促进肿瘤细胞凋亡、抑制增殖、抑制肿瘤侵袭转移有关。

［1］André T，Boni C，Mounedji－Boudiaf L，et al.Oxaliplatin，fluorouracil，and leucovorin as adjuvant treatment for colon cancer［J］.N Engl J Med，2004，350(23):2343－2351.

［2］André T，Boni C，Navarro M，et al.Improved overall survival with oxaliplatin，fluorouracil，and leucovorin as adjuvant treatment in stage II or III colon cancer in the MOSAIC trial［J］.J Clin Oncol，2009，27(19):3109－3116.

［3］Li X L，Wang C Z，Mehendal S R，et al.Panaxadial，a purified ginseng component，enhances the anti－cancer effects of 5－fluorouracil in human colorectal cancer cells［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2009，64(6):1097－104.

［4］Bernhaus A，Fritzer－Szekeres M，Grusch M，et al.Digalloylresveratrol，a new phenolic acid derivative induces apoptosis and cell cycle arrest in human HT－29 colon cancer cells［J］.Cancer Lett，2009，274(2):299－304.

［5］Fishbein AB，Wang CZ，Li XL，et al.Asian ginseng enhances the antiproliferative effect of 5－fluorouracil on human colorectal cancer:comparison between white and red ginseng［J］.Arch Pharm Res，2009，32(4):505－513.

［6］叶晔，阮善明，沈敏鹤，等.中医补益法优化干预结肠癌辅助治疗阶段的实验研究［J］.世界中医药，2011，6(5):440－443.

［7］宋巧玲，阮善明，沈敏鹤.益元汤对BALB/c 小鼠CT－26结肠癌抑瘤作用的实验研究［J］.中华中医药学刊，2011，29(10):2362－2364.

［8］Cichy J，Pure E.The liberation of cd44［J］.Cell Biol，2003，161(5):839－843.

［9］Smith SM，Cai L.Cell Specific CD44 Expression in Breast Cancer Requires the Interaction of AP－1 and NFκB with a Novel cis－Element［J］.PLoS One，2012;7(11):e50867.

［10］Jeong BJ，Liang ZL，Huang SM，et al.CD44 is associated with tumor recurrence and is an independent poor prognostic factor for patients with localized clear cell renal cell carcinoma after nephrectomy［J］.Exp Ther Med，2012，3(5):811－817.

［11］Bánky B，Rásó－Barnett L，Barbai T，et al.Characteristics of CD44 alternative splice pattern in the course of human colorectal adenocarcinoma progression［J］.Mol Cancer，2012，11:83.

［12］Kim DY，Kim HR，Shim JH，et al.Significance of Serum and tissue carcinoma bryonic antigen for the prognosis of gastric carcinoma patients［J］.Surg Oncol，2007，74(3):185－192.

［13］Peng Y，Wang L，Gu J.Elevated Preoperative Carcinoembryonic Antigen(CEA)and Ki67 Is Predictor of Decreased Survival in IIA Stage Colon Cancer［J］.World J Surg，2013，37(1):208－13.

［14］Ozkan E，Soydal C，Araz M，Aras G.Serum carcinoembryonic antigen measurement，abdominal contrast－enhanced computed tomography，and fluorine－18 fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography in the detection of colorectal cancer recurrence:a correlative study［J］.Nucl Med Commun，2012，33(9):990－994.

［15］Hermunen K，Haglund C，Osterlund P.CEA Fluctuation During a Single Fluorouracil－based Chemotherapy Cycle for Metastatic Colorectal Cancer［J］.Anticancer Res，2013，33(1):253－260.