乌司他丁对大鼠心肺复苏后早期脑能量代谢的影响

杨 晴，李新宇，马传根，郭素莲，信文启，张 挚，李 渊

(1河南大学淮河医院，河南开封475000;2兰州军区乌鲁木齐总医院)

心肺复苏(CPR)的本质是全身组织器官的缺血再灌注损伤(I/R)［1］。I/R是一个复杂的病理生理过程，包括缺血期的原发性损伤和再灌注期的继发性损伤。能量代谢障碍在脑I/R的损伤机制中作为始动因素存在，是心脏骤停(CA)后脑组织损伤的主要病理生理改变，是引发脑缺血后损伤机制的关键步骤。若能预防或减轻因I/R引起的三磷酸腺苷(ATP)含量的降低，则有可能防止脑损伤级联反应的发生发展。乌司他丁(UTI)是一种广谱的水解酶抑制剂，对CPR后脑I/R具有良好的保护作用［2］。UTI能否在缺血早期缓解ATP耗竭这一最早发生的代谢紊乱，并能在自主循环恢复(ROSC)后尽早恢复ATP水平尚无定论。2011年3月～2012年3月，我们采用窒息型大鼠CA与CPR模型，研究UTI对大鼠复苏早期(1 h)脑组织能量代谢的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组 清洁级成年健康雄性SD大鼠60 只，体质量350 ～450 g，平均(385．8±13．4)g。随机分为假手术对照组(C组)、生理盐水组(N组)、UTI组(U组)，每组20只。术前禁食12 h，自由饮水。

1．2 CPR模型建立 采用窒息法并加以改进建立大鼠CPR模型［3］。实验参数设计和记录均参照复苏实验研究的Utstein模式［4］。3%戊巴比妥钠(35 mg/㎏)腹腔注射麻醉，将动物仰卧固定于手术台上，从左股静脉置入24号套管针保留静脉通道，分离右侧颈总动脉，远心端用0号丝线结扎，近心端插入注满肝素的22号套管针连接压力换能器，使用MP50多参数监护仪(德国飞利浦)监测有创动脉血压，插四肢皮下电极监测标准肢体导联心电图，气管切开置管(用来接呼吸机)。大鼠手术后室温下稳定10 min，N组和U组于呼气末夹闭气管导管，窒息7～9 min，待大鼠心跳停止后3 min开始开放气道，进行CPR:HX-300S动物呼吸机行机械通气(呼吸频率80次/min，潮气量8 mL/kg，100%氧气)，同时行胸外心脏按压，按压频率160次/min，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3，同时经股静脉推注肾上腺素20μg/kg，必要时追加同等剂量，直至ROSC。记录窒息至CA时间(从开始夹闭气管至CA的时间)和ROSC时间(从开始CPR到确认自主循环已恢复的时间)，15 min无效者放弃复苏，且CPR后处死时相之前发生死亡的，该动物实验数据无效，另外进行补充实验。C组仅行麻醉、气管插管、左股静脉和右颈动脉穿刺，不进行夹管窒息及CPR。

各组均于ROSC后2 min内经股静脉予以下处理:①N组给予2 mL生理盐水;②U组给予UTI(广东天普生化医药股份有限公司，批号:03090921)100 000 U/kg，与生理盐水配伍成2 mL溶液。各组大鼠体质量、麻醉药用量、肾上腺素用量、窒息至心脏停搏时间、复苏至ROSC时间差异无统计学意义。

1．3 脑组织三磷酸腺苷(ATP)和乳酸(LA)含量测定 C组于气管切开置管后1 h，N组和U组于ROSC后1 h快速断头处死，在冰袋上迅速取左侧大脑组织，液氮冷冻，批量待测。采用分光光度计测定脑组织中ATP和LA［5］。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1．4 海马组织病理观察 大鼠处死后按照鼠脑解剖图谱分离大鼠海马组织，取1 mm×1 mm×1 mm大小左侧海马组织快速置于4%戊二醛液中固定，丙酮或乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，经锇酸染色制成超薄切片。H-600型透射电子显微镜下观察海马组织超微结构变化。

1．5 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件。计量资料以¯x±s表示，多组比较采用方差分析。方差齐性检验采用Levene＇s法，方差齐时多组间均数比较采用LSD法，方差不齐时采用Tamhane＇s检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 脑组织ATP和LA 与C组比较，N组和U组大鼠脑组织ATP含量在ROSC后1 h均明显下降(P均＜0．05)，而N组和U组大鼠脑组织LA含量在ROSC后1h均明显升高(P＜0．01);与N组比较，U组大鼠脑组织ATP显著升高(P＜0．05)，而U组大鼠脑组织LA显著降低(P＜0．05)，详见表1。做散点图后发现ATP和LA之间有线性相关趋势，进一步做相关性分析发现ATP与LA呈负相关(r=－0．535，P ＜0．05)。

2．2海马组织超微结构C组可见海马神经细胞各细胞器结构清楚，线粒体呈椭圆形，大小正常，嵴规则，膜结构完整;N组ROSC后1 h海马神经细胞各细胞器结构破坏，线粒体肿胀，部分出现空泡，嵴排列不规则;而U组ROSC后1 h海马神经细胞各细胞器结构尚清楚，病变明显轻于N组，线粒体轻度肿胀，嵴排列略有不规则，膜结构完整。

3 讨论

研究发现，CA后脑血流中断4～5 min ATP就会耗竭［6］，ATP先于一些介质最早发生功能障碍，使细胞膜上离子泵功能障碍，细胞不能维持正常膜内外离子浓度梯度，出现K+外流、Na+内流伴随Ca2+和 Cl－分布异常，影响脑细胞功能［7］。ATP 是CA后各种代谢紊乱和引起脑组织损伤的中心环节。提高缺氧脑细胞中ATP水平可减轻炎性细胞因子损伤、兴奋性氨基酸释放、自由基生成、凋亡基因激活等一系列病理生理反应，减轻脑组织损伤。

表1 各组脑组织ATP和LA水平比较(¯x±s)

CA后血糖、血氧供应中断，线粒体有氧供给剧减，细胞质内无氧酵解增强，LA增多，CO2、H+等代谢产物堆积，造成细胞内酸中毒和高渗透压。LA水平升高一方面可抑制线粒体的功能，已有研究发现，当PH值低于6时，线粒体呼吸功能受到不可逆损伤;另一方面可加重NAD/NADH破坏，使其储备减少，自由基生成增加，并可加速脂质过氧化过程，加重脑损伤。因而及时有效地清除脑LA有助于复苏后脑细胞的成活。本研究结果显示，与C组相比，N组ROSC后1 h脑组织ATP含量明显降低、LA水平明显升高，说明复苏后大鼠脑组织处于氧合代谢不全状态。脑组织ATP和LA存在负直线相关关系，提示CPR后脑组织ATP产生越少，能量代谢障碍越重，无氧酵解越强，LA产生增多导致LA堆积和酸中毒，二者相互影响，相互促进，恶性循环，进一步加重脑损伤。

UTI是含有143个氨基酸的糖蛋白，半衰期为40 min，是一种蛋白酶抑制剂，能够抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性［8］。本研究结果显示，U组ROSC后1 h脑组织ATP水平较N组显著升高，而LA水平较N组显著降低。表明UTI可降低ROSC后大鼠脑组织LA水平，提高ATP水平。大量的实验和临床研究显示UTI通过以下机制提高CA/CPR后的ATP水平，减少LA产生，减轻脑组织损伤:UTI可阻断I/R时Ca2+超载所致的磷脂酶激活途径，保护细胞膜和溶酶体膜，提高线粒体的呼吸功能，使ATP增加;实验发现UTI腹腔注射入沙土鼠脑I/R模型后具有抗脑缺血引起的脂质过氧化反应和清除自由基效应，可保护脑组织免受自由基损伤［9］;Masuda等［10］发现应用UTI可恢复再灌注后心肌能量代谢，能够通过抑制心肌细胞线粒体氧化磷酸化能力的减弱，维持线粒体功能，较快恢复细胞能量供应;UTI的分子结构中有与细胞膜受体结合的位点，并且第10位丝氨酸上有带负电荷的糖链，可以起到稳定溶酶体膜的生理功能，溶酶体功能与ATP代谢间存在较强相关关系，因此UTI能提高复苏后大鼠脑组织ATP水平;Wiedow等［11］研究表明嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶在细胞信号转导和控制炎症进程中起到重要作用，UTI作为丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制过度的炎症反应，Li等［12］研究结果也显示UTI能抑制单核巨噬细胞、中性粒细胞释放炎症介质，抑制过度的炎症反应，从而有助于能量代谢的进行。通过上述机制，UTI能够切断失控的炎症反应，减少氧自由基的生成，改善毛细血管通透性，从而改善脑微循环和脑组织灌注，缓解组织的缺氧，有效保护脑等器官的功能［13］。随着缺血缺氧的改善，LA生成减少，而脏器功能改善也增强对LA的分解代谢能力，通过上述机制UTI能部分改善脑能量代谢，减轻脑组织LA酸中毒，在复苏早期(1 h)即能显示出疗效。

线粒体是细胞产能和储存能量的细胞器，I/R时自由基脂质过氧化和Ca2+超载等原因导致线粒体结构破坏和功能异常，大量的线粒体的破坏导致脑组织发生继发性能量代谢障碍。从某种意义上说，线粒体是脑损伤后神经细胞退行性变的关键［14］。U组ROSC后1h海马神经细胞各细胞器结构尚清楚，病变明显轻于N组，线粒体轻度肿胀，嵴排列略有不规则，膜结构完整，表明UTI可以通过保护线粒体使CPR后的细胞超微结构和呼吸功能都得到了一定的恢复。其保护线粒体的作用可能与UTI稳定溶酶体膜、抑制炎症介质过度释放及清除氧自由基等有关［15］。

本研究结果证实，UTI可改善CPR早期脑能量代谢，减轻脑损伤。但其最佳剂量及给药时机有待进一步研究。

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