TRFIA 法检测总免疫球蛋白E的分析灵敏度及可报告范围的建立

谭玉华，孙宝清

(广州医科大学附属第一医院广州呼吸疾病研究所，呼吸疾病国家重点实验室，广州 510120)

分析灵敏度为检测系统可检测的最低分析物浓 度，包括检测低限(LLD)、生物检测限(BLD)和功能灵敏度(FS)［1］，而可报告范围(RR)指可以报告的所有结果的范围，包含分析测量范围(AMR)和临床可报告范围(CRR)［2］。免疫球蛋白E(IgE)是Ⅰ型超敏反应中的反应素，在过敏性疾病诊断中的价值已得到公认，IgE 是正常人血清中含量最低的一种Ig，特别是生儿脐带血中IgE 含量极低(＜1.0 IU/mL)［3］，脐带血IgE 升高对变应性疾病具有重要预测价值［4］，筛选值定为1.2 IU/mL，脐带血IgE的特异性可达到95%［5］。在过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等疾病中IgE 会有不同程度的升高，特别在过敏性支气管肺曲菌病时最为显著，其血清总IgE 值可达349～13 000 IU/mL［6］，现血清总IgE 指标已列入了变应性支气管肺曲菌病的诊断标准［7，8］。除了变应性支气管肺曲菌病和特应性皮炎以及在花粉季节之外，任何血清总IgE 水平大于5 000 ng/mL(2 083.33 IU/mL)的患者均应考虑寄生虫感染的可能性。因此确定总IgE 检测系统的分析灵敏度和可报告范围是重要的分析性能。本研究参考文献［1，9～11］和EP6-A 文件，观察自建的总IgE 时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)系统分析灵敏度，并建立可报告范围。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试验操作要求 TAKEEN-Ⅰ型TRFIA仪及其配套的总IgE 测定试剂、校准品、质量控制品、FWZ-Ⅰ型微量振荡器、DEM-Ⅲ型全自动洗板机(广州市丰华生物工程有限公司)。试验严格按照试剂盒说明书、仪器的运行程序及操作规程操作并确保仪器运行处于良好状态，分析过程中全程质量控制在控。

1.2 样本制备 以下所用样本外观澄清，均无溶血、无脂血和无黄疸。①分析灵敏度试验样本:将0 IU/mL的校准品A 作为空白样本(S0)，将12 IU/mL的校准品用校准品A 稀释成0 IU/mL 、0.25 IU/mL、0.50 IU/mL、1.00 IU/mL、2.00 IU/mL、4.00 IU/mL 和8.00 IU/mL的总IgE 系列分析灵敏度样品。②AMR 试验样本:选择1例低浓度样本(L，1.21 IU/mL)和1例高浓度样本(H，2001.01 IU/mL)，为发现最宽的AMR，将预期测定范围加宽至130%左右，L 和H 按照10L、9L+1H、8L+2H、7L+3H、6L+4H、5L+5H、4.5L+5.5H、4L+6H、3.5L+6.5H、3L+7H、2.5L+7.5H、2L+8H、1.5L +8.5H、1L+9H 和10H 进行精确混合，每个浓度水平的样本量为1.0 mL，形成系列AMR 试验样品。③CRR试验样本:选择3 份高浓度的样本(1 180.85 IU/mL，1 510.04 IU/mL，1 352.54 IU/mL)，分别用样本稀释液作10、20、50、100、200 倍稀释。上述样本均外观澄清，无溶血、无脂血、无黄疸。

1.3 分析灵敏度确定 ①LLD:参考文献［1，11］将总IgE的S0做20 次批内重复测定，其它系列分析灵敏度样品做20 批次天间重复测定，每天均采用双孔检测取平均值，采用初始荧光强度值(CPs)表示。计算20 次S0的CPs的平均值(χ空白)和标准偏差(s空白)，按99.7%可能性定义LLD，计算公式为LLD=χ空白+3 s空白，然后转换为浓度单位。②BLD:检测响应量的99.7%单次检测量最低值也较LLD 大，以LLD的CPs 为界，系列低浓度的分析灵敏度样品的CPs 结果中，某浓度下的CPs 均值减去3 倍该样品的CPs的标准差，仍大于、并与LLD的CPs 最接近的对应浓度为BLD，以99.7%的可能性定义BLD，BLD=LLD +3s。③FS:以天间重复变异系数(CV)为20%时对应分析灵敏度样品具有的平均浓度，确定为检测系统可定量报告分析物的最低浓度的限值，选择天间CV 具有或接近20%时的浓度为FS。

1.4 可报告范围建立 ①AMR 确定:参考文献［2，9，10］和EP6-A 文件［11］将系列AMR 试验样品在总IgE TRFIA 系统上重复测定4 次，将实测值与预期值作比较，以预期值为X 轴，实测值为Y 轴，若所有试验点呈明显直线趋势，对数据用直线回归统计处理。得到Y=bX+a，若线性相关系数(r)≥0.975，且b 在1.00±0.03 范围内，a 接近于0，则可直接判断该测定系统的AMR 在试验已涉及浓度。②CRR 确定:将系列CRR 试验样本在总IgE TRFIA系统上重复测定3 次，实测值与稀释后对应的预期值作比较，计算稀释回收率，回收率在80%～120%为可接受性的判断标准，从而确定样本最大的稀释倍数，ARM 乘以最大稀释倍数即为CRR的上限，以FS 为可定量报告的下限，从而确定了CRR。

1.5 统计学方法 TRFIA 测量所得荧光计数采用TRFIA 仪上随机配备的分析软件进行数据分析。其他数据采用SPSS13.0 和Microsoft Excel 软件进行统计分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分析灵敏度

2.1.1 LLD 总IgE的S0的χ空白和s空白分别为1 137.73和147.31，采用99.7%的可能性计算检测低限。LLD=χ空白+3 s空白=1 137.73 +3 ×147.31=1 579.66。若以S0的CPs 平均值为检测的起点0，那么有99.7%的可能性，每次只做一个空白时，出现最高的空白CPs 值较该空白CPs 平均值高3 倍，即441.93，这些CPs 值相当于样品具有的总IgE的量，即为本系统总IgE的检测低限。将上面所有低浓度分析灵敏度样品的CPs 值减去空白CPs 平均值，然后求每组的平均值和标准差。0.25 IU/mL 总IgE组减去空白后的CPs 平均值为521.35，假定这段范围内总IgE量和CPs 值间呈线性。因此441.93 相当于:0.25 ×(441.93/521.35)=0.21 IU/mL。所以本系统总IgE的LLD 为0.21 IU/mL。

2.1.2 BLD 0.50 IU/mL 总IgE组99.7%的最低CPs 值为1554.65－3 ×368.62，即448.79，已大于空白CPs 平均值可能有的最高值441.93，说明0.50 IU/mL的样品CRs 值有99.7%的可能性，一定大于空白的CRs 值，能定量地报告结果。0.50 IU/mL 为本系统总IgE的BLD。

2.1.3 FS 1.00 IU/mL 总IgE组的CV 为19.82%，接近20%。所以，本系统总IgE的FS 为1.00 IU/mL。

2.2 可报告范围

2.2.1 AMR 系列AMR 试验样品的检测结果如表3。本研究舍去1.5L +8.5H组、1L +9H组和10H组数据，在1.12～1 601.03 IU/mL 范围内，实测值与预期值的线性回归方程为Y=0.9919X +1.1199，R2=1，b 接近于1，且截距与0 差异无统计学意义，确定AMR 为1.12～1 601.03 IU/mL。

2.2.2 CRR 本研究的第1 份和第3 份样本的最大允许稀释倍数均为1 ∶100，其稀释回收率均在80%～120%内，则CRR的上限为AMR 乘以最大稀释倍数，即1 601.03 ×100=160 103 IU/mL，结合FS的结果，确定CRR 为1.00～160 103 IU/mL。

3 讨论

根据国际标准化组织《医学实验室质量和能力的专项要求》(ISO15189)和中国《医疗机构临床实验室管理办法》，对检测系统的主要方法学性能进行验证或评价证实其能够达到相应标准后才能应用于临床检测［9，10］。分析灵敏度和可报告范围是检测系统自身特性的评估指标，分析灵敏度是检测系统的可报告定量结果的最低限，也是整个可报告范围的起点［13］。患者结果可报告范围，这是评估的前提［12］。如不清楚检测系统的可报告范围，无法选择样本作方法学比较。AMR 指样本没有经过任何预处理(浓缩或稀释)，检测方法能够直接测定出待测物的范围，也就是系统最终的输出值(活性或浓度)与被测物的活性或浓度呈线性比例的范围，它反映整个系统的输出特性。CRR 是指对临床、诊断有意义的待测物浓度范围，此范围如果超出了AMR，可将样本通过稀释、浓缩等预处理是待测物浓度处于分析测量范围内，最后乘以稀释或浓缩的倍数。美国病理学会(CAP)要求定量检测项目须进行ARM验证试验，并确定每个项目的CRR［13］。

检测系统是完成一个项目检测所涉及的仪器、试剂、校准品、操作程序、质量控制、保养计划等的组合［14］，在检测系统正式用来检测患者标本、发出检验报告前，实验室需对系统的操作分析性能做试验予以验证或评价证实。TRFIA 是20 世纪80年代迅速发展起来的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术，非常适用于生物学、医学上的超微量分析，其应用范围不断发展已经成为临床及治疗监测和基础医学研究等方面的重要手段。本研究对自建的总IgE CTRFIA 定量检测系统的LLD、BLD、FS、AMR 和CRR进行了计算。结果显示本系统LLD 为0.21 IU/mL，BLD 为1.00 IU/mL，FS 为1.00 IU/mL，表明此TRFIA系统检测总IgE 分析灵敏度高，在脐带血IgE 定量检测中具有潜在价值。CAP 对临床开展的一些项目提供线性验证品，我国尚未有临床化学发光免疫检验的线性验证品。线性评价可采用多种方式进行，一种为简单、客观的方法，就是评价测量和预期浓度之间的关系是否是直线;另一常见应用方法决定非线性是评价估计回归线的残差及检验正或负的偏离是否是随机分布［15］。近年来，关于线性的认可趋向于实际、方便的判断的做法，而且用患者的结果可报告范围的概念替代了线性，应予以关注。因此本研究采用了第一种简单直观的方法，选择低浓度与高浓度血清按一定比例关系配制，并将预期测定范围加宽至130%左右，在此范围内选择了更多的浓度水平，这样形成系列AMR 试验样品，将实测值与预期值作比较，逐渐减少数据点直至表现出线性关系，这样可发现检测系统的最宽的AMR。本研究结果表明总IgE TRFIA 系统的AMR 为1.12～1 601.03 IU/mL。对于那些高值也有特别临床意义的检测项目，并且这些项目的高值高于AMR，CRR的验证或评价证实是十分重要的，总IgE 已作为过敏性疾病诊断与鉴别诊断、寄生虫感染性疾病、免疫功能障碍相关性疾病的实验室评估指标，在某些疾病中(如过敏性支气管肺曲菌病)水平升高明显，超过AMR的结果均要在最大允许稀释倍数内进行稀释后检测。因此本研究通过高浓度样本稀释一定倍数，确定了可最大允许稀释倍数为1∶100，得到了本系统的CRR 上限为160 103 IU/mL，并结合FS，CRR 下限为1.00 IU/mL，在此范围之外的结果不可靠。因此对于低值和高值有意义检测项目应对检测系统的分析灵敏度和可报告范围进行建立或评价，能更好的保证检验质量，为临床提供准确有效的信息。本研究总IgE TRFIA 检测系统的LLD、BLD、FS、AMR 和CRR 可满足临床需要。

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