三维试验检测耐头孢他啶铜绿假单胞菌产β－内酰胺酶

陈 红（湖南省益阳市第三人民医院检验科 413000）

铜绿假单胞菌为专性需氧非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然环境中，是医院及社区感染中常见病原菌，可引起包括皮肤软组织感染、肺炎、败血症等在内的多种疾病［1］。近年来，随着广谱抗菌药物广泛使用，铜绿假单胞菌多重耐药现象日趋严重。有研究表明，铜绿假单胞菌产生各种产超广谱β－内酰胺酶（ESBLs），是其对β－内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制［2］。为了解本院铜绿假单胞菌产β－内酰胺酶现状，本研究对2009年6至2012年5月本院临床标本中出现的耐头孢他啶铜绿假单胞菌采用改良三维试验检测其β－内酰胺酶，报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2009年6月至2012年5月本院临床标本中分离的耐头孢他啶铜绿假单胞菌非重复菌株65株。

1.2 试剂 M－H培养基干粉购自英国Oxoid公司，克拉维酸（CLA）、氯唑西林（CLO）购自中国药品生物制品检定所，其余所有药敏纸片均购自英国Oxoid公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定及药敏试验 各临床科室送检标本经培养后取可疑菌落按《全国临床检验操作规程》（第3版）进行操作鉴定。药敏试验采用K－B法，结果判定参照2012年美国临床实验室标准化协会标准执行。以大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）为标准质控菌株。

1.3.2 改良三维试验检测ESBLs、AmpC和金属酶 三维试验参照文献［3］并进行改良。酶粗提物制备：取纯培养菌落2～3个，涂在1/4M－H平皿上37℃孵育过夜；刮下菌苔于1mL生理盐水中，4℃，4 000r/min离心20min后弃上清液，加入700μL生理盐水于EP管中，－20℃保存，反复冻融6次，4℃，12 000r/min离心20min，上清液经常规细菌培养结果为阴性后，置－20℃保存备用。三维试验：取2个M－H平皿，分别均匀涂布0.5麦氏单位大肠埃希菌（ATCC 25922），平皿中央分别贴30μg头孢噻肟和亚胺培南，距离纸片边缘5mm处打孔，贴头孢噻肟的平皿分别加45μL酶粗提液加5μL生理盐水、45μL酶粗提液加5μL 2mmol克拉维酸、45μL酶粗提液加5μL 2mmol氯唑西林、45μL酶粗提液加5μL 2mmol克拉维酸加5μL 2mmol氯唑西林；贴亚胺培南的平皿分别加45μL酶粗提液加5μL生理盐水、45μL酶粗提液加5μL 0.5 mol乙二胺四乙酸（EDTA）于孔中，避免酶粗提液溢出孔外，35℃温箱孵育过夜。孔与抑菌圈交界处出现扩大的长菌区域，表明该酶能水解头孢噻肟或亚胺培南，同时观察能否被CLA、CLO和EDTA所抑制。以阴沟肠杆菌为阳性对照，以大肠埃希菌（ATCC 25922）为阴性对照。

2 结 果

2.1 药敏试验 65株耐头孢他啶铜绿假单胞菌药敏试验结果 见表1。

表1 65株耐头孢他啶铜绿假单胞菌药敏试验（%）

2.2 改良三维试验测定65株耐头孢他啶铜绿假单胞菌 见表2。65株耐头孢他啶铜绿假单胞菌中，单产ESBLs 30株，单产AmpC酶4株，同时产ESBLs和AmpC酶10株，同时产ESBLs和金属酶15株，同时产AmpC酶和金属酶2株，产其他β－内酰胺酶4株。

表2 65株耐头孢他啶铜绿假单胞菌药物敏试验结果

3 讨 论

头孢他啶是治疗铜绿假单胞菌感染的一线药物。近年来，随着β－内酰胺类抗菌药物的广泛应用，铜绿假单胞菌对头孢他啶的耐药性明显上升，且常因对多种抗菌药物耐药而导致治疗失败，已成为临床抗感染治疗的棘手难题。由表1可见，耐头孢他啶的铜绿假单胞菌通常伴有其他多类抗菌药物耐药。目前引起临床关注的β－内酰胺酶有：ESBLs、AmpC、对酶抑制剂敏感性下降的β－内酰胺酶（IRTs）、金属酶和非金属酶的碳青霉烯酶。铜绿假单胞菌对β－内酰胺类药物耐药主要产生各种β－内酰酶，它们可定位于质粒或染色体上，对β－内酰酶高度耐药和酶抑制剂耐药。在院内感染的监测中，为了便于及时切断耐药基因的传播，监测细菌的产酶机制有十分重要的意义［4］。

改良三维试验利用ESBLs能被CLA抑制，不被CLO抑制；AmpC酶则不能被CLA抑制，但可被CLO抑制；金属酶可被EDTA抑制等特性来检测ESBLs、AmpC酶和金属酶。采用细菌酶液进行操作，避开细菌外膜渗透机制和抗菌药物泵出机制对试验的干扰，因而不受抗菌药物的诱导、细菌表型和外界因素的影响，可更准确地同时检测铜绿假单胞菌ESBLs、AmpC酶和金属酶［5－6］。由表2可见，46.2%（30/65）菌株单产ESBLs，6.2%（4/65）菌株单产 AmpC酶，15.4%（10/65）菌株同时产ESBLs和AmpC酶，23.1%（15/65）菌株同时产金属酶和ESBLs，3.1%（2/65）菌株同时产 AmpC酶和金属酶，6.2%（4/65）菌株产其他β－内酰胺酶，这与文献［3，7－9］报道的有所不同，可能与各地区使用抗菌药物的种类和频率不同有关。本研究结果表明，本院耐头孢他啶铜绿假单胞菌产ESBLs达84.7%，产金属酶和 AmpC酶分别为26.2%和24.7%，而41.6%的菌株同时产两种β－内酰胺酶。说明本院分离铜绿假单胞菌不仅产酶高，而且产酶种类较多，可能是对β－内酰胺酶类药物广泛耐药的重要机制，应引起临床高度重视。

综上所述，本院耐头孢他啶铜绿假单胞菌对β－内酰胺酶类药物耐药主要与其产ESBLs有关，其次为AmpC酶和金属酶。控制产酶菌株在本院的播散及流行已刻不容缓，临床在治疗该类细菌感染时，应及时根据药敏试验结果合理选用抗菌药物。

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