死亡相关蛋白激酶1基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义

李 琦，胡昌华，万光华，张 婧（.湖北省武汉市武汉科技大学附属汉阳医院妇产科 430050；2.湖北省襄阳市中心医院妇产科 4402）

宫颈癌的发病机制主要与基因表达改变有关，表观遗传学在其发病机制中扮演重要角色，其中抑癌基因启动子甲基化引起的表观遗传学改变被认为是最重要的发病机制［1－2］。死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）为钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可正性调控细胞凋亡，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，在肿瘤中普遍存在高甲基化状态［3－4］。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）检测宫颈癌组织和癌旁组织

DAPK1基因启动子甲基化状态，研究DAPK1基因在宫颈癌诊断、病情和预后评估中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2010年1月至2012年1月手术治疗的80例初治宫颈癌患者，均经症状体征、体格检查、影像学及病理组织学检查确诊。年龄30～85岁，平均（50.6±15.4）岁；病理组织类型包括鳞状细胞癌60例，腺癌12例，腺鳞癌8例；根据2009年国际妇产科联盟（FIGO）宫颈癌分期，其中Ⅰ期20，Ⅱ期35例，Ⅲ17例，Ⅳ期8例。

1.2 方法 检测标本均取宫颈癌患者手术切除肿瘤组织和距肿瘤组织大于5cm癌旁组织，标本取材后立即置于液氮中保存。DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。引物由大连宝生物工程有限公司合成。甲基化修饰试剂盒购于北京天漠公司。DAPK1基因启动子甲基化MSP检测，按基因组DNA试剂盒说明书进行，提取宫颈癌组织和癌旁正常组织总DNA。按甲基化试剂盒说明书采用重亚硫酸盐将提取的DNA未甲基化C转化为U，转化后的样本进行PCR扩增。引物采用Methyl Primer Express V1.0设计，序列见表1，PCR反应体系为25μL，循环条件为：95℃预变性10min，95℃变性1min，65℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，最后一轮72℃延伸10min。扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳后检测。

表1 RASSF1A基因MSP甲基化引物

1.3 统计学方法 采用Sigmaplot 11.0统计软件进行数据处理及统计学分析。计数数据采用χ2检验或Fisher精确计算P值。检验水准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈癌组织和癌旁组织检测结果 80例患者中宫颈癌组织有50例DAPK1基因启动子呈甲基化状态，甲基化率为62.5%，癌旁组织中有4例DAPK1基因启动子呈甲基化状态，甲基化率为5.0%，宫颈癌组织中DAPK1基因启动子甲基化率显著高于宫颈癌癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 RASSF1A基因启动子甲基化MSP结果

2.2 DAPK1基因启动子甲基化与临床病理因素的关系 见表2。宫颈癌癌组织DAPK1基因启动子甲基化率在年龄和病理中差异无统计学意义（P＞0.05），在组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、器官转移、FIGO分期中差异均有统计学意义（P＜0.05），组织学分级高、肿瘤最大径大、有淋巴结转移及器官转移、FIGO分期晚的癌组织DAPK1基因启动子甲基化率高于组织学分级低、肿瘤最大径小、无淋巴结转移及器官转移、FIGO分期早的癌组织。

表2 DAPK1基因启动子甲基化与临床病理因素的关系

3 讨 论

基因甲基化是最重要的表观遗传学调控机制，真核生物的DNA中高达80%的CpG位点发生甲基化改变，这些甲基化主要分布在基因启动子区域的CpG岛，CpG位点的甲基化可引起染色体及DNA空间构象发生改变，主动或被动阻遏转录因子结合到转录起始点而调控基因表达［5］。研究表明，基因启动子甲基化与肿瘤的发病机制、病情及预后紧密相关，可作为肿瘤的基因水平生物学标志物，较传统的蛋白水平的肿瘤标志物具有更高的灵敏度及特异性［6］。DAPK1作为新发现的抑癌基因，具有钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的作用，可正性调控细胞的凋亡，在各种细胞凋亡系统中扮演重要角色，被证实与肿瘤的发生、发展和转移紧密相关，其启动子高甲基化改变在乳腺癌及消化系统均可检测到［7－8］，在人乳头瘤病毒诱导发生的宫颈癌组织中其甲基化高达56.3%［9］。本研究中，宫颈癌组织中DAPK1基因启动子甲基化率为62.5%，癌旁组织中甲基化率为5.0%，宫颈癌组织中DAPK1基因启动子甲基化率显著高于宫颈癌癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），由此证实DAPK1基因在宫颈癌中存在高甲基化状态。

研究表明，抑癌基因的表观遗传学改变在肿瘤的诊断、病情评估和预后评估中扮演重要角色，越来越多的基因被发现在肿瘤诊断中表现出极高的灵敏度及特异性。在本研究中，组织学分级高、肿瘤最大径大、有淋巴结转移及器官转移、FIGO分期晚的宫颈癌组DAPK1基因启动子甲基化率高于组织学分级低、肿瘤最大径小、无淋巴结转移及器官转移、FIGO分期早的癌组织，提示DAPK1基因启动子甲基化在宫颈癌病情及预后评估中具有重要作用。肿瘤的组织学分级及分期是公认的与肿瘤病情及预后相关的因素，分化程度越低、分期越晚，患者病情越重，预后越差，生存时间越短，质量越差，基于这个事实，本文认为DAPK1基因启动子甲基化可以作为宫颈癌基因水平的生物学标志物，可为宫颈癌的诊断、病情与预后评估提供证据，尽管较目前的蛋白质生物学标志物的检测繁琐，随着检测水平的提高，会越来越体现出高灵敏度及特异性等优点。

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