沙利度胺联合替尼泊苷对人胃腺癌移植瘤生长的影响

高 明赵 丹张自森马 望张明智*

（1 郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052；2 郑州市第三人民医院肿瘤科，河南 郑州 450000；3 郑州大学第五附属医院肿瘤内科，河南 郑州 450000）

沙利度胺联合替尼泊苷对人胃腺癌移植瘤生长的影响

高 明1赵 丹2张自森3马 望1张明智1*

（1 郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052；2 郑州市第三人民医院肿瘤科，河南 郑州 450000；3 郑州大学第五附属医院肿瘤内科，河南 郑州 450000）

目的 探讨沙利度胺联合替尼泊苷在对胃腺癌BGC-823裸鼠移植瘤生长及肿瘤细胞周期的影响，了解二者联合对移植瘤的抑制作用。方法 建立人胃腺癌BGC823移植瘤模型，实验分组，计算抑瘤率，流式细胞仪检测肿瘤细胞生长周期及凋亡情况。结果 沙利度胺联合替尼泊苷组肿瘤组织S期细胞比例明显下降，大量肿瘤细胞阻滞于G2/M期，并可见明显凋亡峰。结论 替尼泊苷联合沙利度胺对抑制人胃腺癌BGC823细胞生长具有协同作用，可诱导肿瘤细胞凋亡。

沙利度胺；替尼泊苷；胃腺癌

胃癌发病率在恶性肿瘤中非常高，病死率仅次于肺癌排在第二位[1]。早期诊断比较困难，确诊时大多数患者已没有手术机会，主要治疗手段是以化疗为主的综合治疗，有效率较低，现没有标准治疗方案[2]。体外研究发现替尼泊苷(VM-26)对人胃腺癌BGC-823细胞具有良好的抑制生长作用[3]。近年来沙利度胺的动物及体外实验表明其有抑制血管生成等作用，再度受到重视。

1 材料与方法

1.1 材料

①细胞株：人胃腺癌细胞系BGC-823购自中科院上海细胞生物学研究所。②实验动物：6周龄、BALB/c裸鼠50只，雌雄各半，购自中国药品生物鉴定所啮齿类实验动物种子中心。③药物：沙利度胺片（50mg/片）由常州制药馈赠；替尼泊苷注射液由美国百时美施贵宝公司馈赠

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方法

人胃腺癌细胞BGC-823在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中生长。

1.2.2 动物实验

①荷瘤裸鼠模型的建立：取对数生长期细胞消化，加入无血清培养基后离心；应用无血清培养基调整细胞浓度为5×106/mL；每只裸鼠接种1×106（约0.2mL）；②随机分组：50只裸鼠成瘤率100%，随机分为5组：空白对照组、沙利度胺组、低剂量VM-26组、高剂量VM-26组及低剂量VM-26联合沙利度胺组。

1.2.3 实验分组

成瘤后瘤径达5mm时开始给药；VM-26取2.45mg/kg、1.63mg/kg分别作为高剂量及低剂量组实验用药剂量；沙利度胺组采用200mg/(kg·d)作为实验组用药剂量。①空白对照组：尾静脉注射0.2mL生理盐水；②沙利度胺单药组：经口灌胃沙利度胺200mg/(kg·d)，每日给药一次；③VM-26高剂量组：尾静脉注射VM-26注射液2.45mg/kg，每周给药一次；④VM-26低剂量组：尾静脉注射替尼泊苷注射液1.63mg/kg，每周给药一次；⑤沙利度胺联合VM-26低剂量组：经口灌胃沙利度胺200mg/(kg·d)，每日给药1次；尾静脉注射VM-26注射液1.63mg/kg，每周给药1次；分组后次日开始给药，连续2周。

1.2.4 计算肿瘤生长抑制率

在用药前称裸鼠的体质量，与停药次日处死动物，剥出瘤块称重，计算瘤重抑制率。瘤重抑制率=（对照组瘤重-给药组瘤重）/对照组瘤重×100%。

表1 各治疗组抑制肿瘤作用

表2 各治疗组对人胃腺癌细胞生长周期的影响

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期

剥出瘤块制成组织标本-80℃冰箱低温保存，分别制备各组单细胞悬液后，将制备好的胶原蛋白酶溶液2mL加入离心管中；将离心管放入37℃恒温水浴箱消化30min，后收集细胞悬液过滤、离心再加入PBS 2mL充分混匀，再加入0.5mL PBS重悬细胞；加入预冷的70%冷乙醇，放置4℃固定12h。检测时加入RNA酶进行消化，37℃水浴约30min后冰浴，采用碘化丙锭（PI）一步插入性DNA定量荧光染色。每一份样品中约加入DNA染液1.0mL，放入4℃避光染色30min，过滤后制成单细胞悬液，上机检测细胞周期，同时设二抗的本底对照和阴性对照。使用Expo32 ADC进行免疫荧光数据分析，Muticycle AV分析软件分析细胞周期。

1.3 统计学分析

数据应用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，显著性水平α=0.05。

2 结 果

2.1 肿瘤生长抑制情况

所有裸鼠接种细胞48h左右接种部位均可触及米粒大小结节，约5d后明显成瘤，测量瘤体积；空白对照组及各治疗组在用药第1周内，瘤体生长均较缓慢；其后空白对照组移植瘤瘤体呈现迅速生长，而治疗组移植瘤瘤体生长仍较缓慢，以高剂量VM-26组最为显著，其次为联合用药组；具体各组移植瘤情况见表1。

2.2 流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡情况

流式细胞仪分析结果显示G2/M期细胞的阻滞在不同剂量VM-26组而有所不同，低剂量VM-26组细胞阻滞作用很轻微，与空白对照组相比无统计学差异（P＞0.05）；相比之下，高剂量VM-26组可见明显的G2/M期细胞阻滞，与空白对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）；结果提示VM-26对胃癌细胞的阻滞作用是剂量依赖性的。本实验还观察到沙利度胺组也有一定程度的G2/M期细胞阻滞作用，与空白对照组相比同样具有统计学意义（P＜0.05）。而联合用药组G2/M细胞的阻滞作用最为显著，与空白对照组及沙利度胺组比较均有统计学意义（P＜0.05）；结果表明在降低替尼泊苷的剂量之后联合沙利度胺对胃癌细胞的生长仍有明显的抑制作用，对G2/M期细胞阻滞表现出协同作用；同时可见明显的凋亡峰，提示二者的联合可以分别通过不同的途径诱导细胞的凋亡（表2）。

3 讨 论

VM-26和沙利度胺均可阻滞肿瘤细胞的生长，但作用的细胞周期不同。沙利度胺对肿瘤细胞的阻滞则主要表现在G1期。体外研究显示VM-26可将口腔鳞癌细胞和人胃癌细胞阻滞于G2/M期[4,5]，同时认为细胞周期的这种变化与细胞的凋亡有着十分密切的联系。罗执芬等[6]报道在相同摩尔浓度下，VM-26对胃癌BGC-823细胞的抑制率是依托泊甙的5倍以上。马望等[7]报道VM-26和奥沙利铂联合用药对抑制胃癌BGC-823细胞生长有协同作用，并且VM-26与5-氟尿嘧啶联合用药对抑制胃癌BGC-823细胞生长有相加作用。近年来，沙利度胺在实体肿瘤治疗中的作用越来越受到人们的关注。多项研究显示[8]沙利度胺可以下调肿瘤细胞表面的VEGF和bFGF水平，抑制肿瘤血管形成，起抗肿瘤作用。此外沙利度胺还诱导肿瘤细胞凋亡，诱导IL-2的产生，提高NK细胞对肿瘤的杀伤作用和抑制TNF-A的合成以及提高CD8+T细胞的增殖等作用，并且沙利度胺和化疗的联合已经在临床治疗胃癌取得了不错的成绩[9]。

本实验我们应用替尼泊苷联合沙利度胺作用于人胃腺癌移植瘤，流式细胞仪分析显示，高剂量替尼泊苷组和联合用药组S期细胞比例不同程度下降，多数肿瘤细胞阻滞于G2期，而沙利度胺单药组及低剂量VM-26单药组与空白对照组相比S期细胞比例也有所下降，并且联合用药组G2/M细胞的阻滞作用最为显著。结果表明替尼泊苷联合沙利度胺对G2/M期细胞阻滞表现出协同作用，从而对诱导胃癌细胞凋亡起到协同作用，为临床胃癌的治疗提供了新的思路与理论支持。

[1] 孙燕 石远凯.临床肿瘤内科手册[M].5版.北京:人民卫生出版社, 2007:476.

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[3] Wang M,Ming G,Wei H,et al.Oxaliplatin and teniposide can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of gastric cancer cell line BGC-823 synergistically[J].Chinese-German J Clin Oncol, 2010,3(9): 149-152.

[4] 罗执芬,周云,刘明月.替尼泊苷对胃癌细胞BGC-823体外增值的影响[J].郑州大学学报(医学版),2007,42(3):483-484.

[5] Gao S,Yang XJ,Zhang WG,et al.Mechanism of thalidomide to enhance cytotoxicity of temozolomide in U251-MG glioma cells in vitro[J].Chin Med J(Engl),2009,122(11):1260-1266.

[6] 罗执芬,周云.替尼泊甙和依拓泊甙对胃癌细胞体外抑瘤作用比较[J].中国实用医刊,2007,34(11):7-9.

[7] 马望,高明.奥沙利铂联合替尼泊苷抑制胃癌BGC-823细胞生长和诱导凋亡的作用[J].肿瘤,2010,30(1):31-35.

[8] Kakeji Y,Koga T,Sumiyoshi Y,et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor expression in gastric cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res,2002,21(1): 125-129.

[9] 赵福友,王子安,郑荣生.沙利度胺联合化疗治疗晚期胃癌的随机对照研究[J].中华全科医学,2010,98(9):1089-1091.

R735.2

B

1671-8194（2013）23-0058-02

河南省医学科技攻关基金资助(项目编号：201203055)

*通讯作者：E-mail：15231135369@139.com