急性髓性白血病患者外周血淋巴细胞亚群的检测及其临床意义

朱孟霞 许莲蓉* 张耀方

（山西医科大学第二医院血液内科，山西 太原 030001）

急性髓性白血病患者外周血淋巴细胞亚群的检测及其临床意义

朱孟霞 许莲蓉* 张耀方

（山西医科大学第二医院血液内科，山西 太原 030001）

目的 探讨急性髓系白血病（AML）患者外周血T淋巴细胞亚群、DNT细胞、NK细胞的表达水平及其临床意义。方法 采用流式细胞术对40例初发AML患者、32例AML完全缓解（CR）患者及20例正常人外周血T淋巴细胞亚群、DNT细胞及NK细胞水平进行检测。结果 初发AML组与正常对照组比较，CD4+细胞、CD4+/CD8+比值、DNT细胞及NK细胞明显降低（P＜0.05）；CD3+细胞、CD8+细胞变化不显著（P＞0.05）。复治CR组与对照组比较，NK细胞明显降低（P＜0.05），其他各值差异无统计学意义。结论 初发AML患者的T淋巴细胞亚群、DNT细胞、NK细胞变化明显，而治疗缓解后淋巴亚群基本恢复正常，说明T淋巴细胞亚群、DNT细胞、NK细胞水平检测在评价AML疗效及判断预后方面具有一定的临床价值。

白血病；髓样；急性；淋巴细胞亚群；免疫功能

急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其发生、发展与机体免疫紊乱有着密切的关系。因此，检测AML患者淋巴细胞亚群水平对于探讨白血病免疫异常及指导治疗有重要的意义。本文采用流式细胞术检测AML患者在初发及完全缓解后外周血T淋巴细胞亚群及自然杀伤（NK）细胞的变化，观察细胞免疫功能变化并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

①材料：急性髓系白血病患者40例（初发组），均为我院2012年6月至2013年5月住院患者，所有患者均进行MICM分型，诊断标准采用张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[1]，排除合并有其他恶性肿瘤以及免疫相关疾病的患者。其中男性22例，女性18例，中位年龄35岁（年龄13～56岁），AML亚型：M1 4例，M2 11例，M3 7例，M4 10例，M5 7例，M6 1例。已经确诊并经系统化疗达完全缓解的AML患者为复治组共32例，20名健康人（对照组）为我院正常体检者。三组患者的年龄、性别间具有均衡性。②试剂及仪器：CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5、CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE抗体购自美国BD公司。溶血素购自美国Beckman Coulter公司。PBS洗涤液及含1%多聚甲醛的固定液由本实验室自行配制，离心机及流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品。

1.2 方法

①标本采集：初发和CR患者均于入院未治疗前抽取清晨空腹外周血2mL，对照组随机抽取清晨空腹外周血2mL，EDTA抗凝，6h内标记抗体。②淋巴细胞亚群检测方法：采用直接免疫荧光标记法进行单克隆抗体标记，取两个检测管标记为N管、T管，分别加入4.5μL单克隆荧光抗体CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE及CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，加入样本35μL、PBS缓冲液25μL，混匀，室温下避光作用15min后，加溶血素100μL，混匀，待红细胞溶解后，用PBS洗涤，1000r/min离心5min，弃上清，最后加500μL固定液，避光静置30min后上机检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（χ—±s）表示，多组均数间比较采用方差分析，两两检验采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

表1 AML患者及正常对照组外周血淋巴细胞亚群测定结果（%，χ—±s）

2.1 初发组的CD4+细胞、CD4+/CD8+比值较CR组及对照组均降低（P＜0.05），CD3+细胞、CD8+细胞较其他两组均无明显差异（表1）。

2.2 初发组的CD3+CD4-CD8-细胞较CR组及对照组均降低（P＜0.05），而CR组与对照组间无明显差异（P＞0.05）。

2.3 初发组及CR组的CD16+CD56+细胞较对照组均降低（P＜0.05），而初发组与CR组间无明显差异（P＞0.05）。

3 讨 论

细胞免疫功能缺陷、免疫监督不力是肿瘤发生、发展的重要原因之一，研究已经证实急性白血病患者存在淋巴细胞数量减少和功能的缺陷，从而导致肿瘤杀伤能力下降，其中淋巴细胞数量的减少多以CD4+淋巴细胞减少为主[2-3]。

CD4+/CD8+比值反映机体免疫功能的调节能力，其比值平衡是机体维持免疫内环境稳定的中心环节[4]。以往报道中急性白血病患者外周血中CD8+T数据略有差异[5-6]，但总体呈相对增多状态。本实验发现，初发AML中CD4+T、CD4+/CD8+比例明显降低，而CD8+T绝对数量无明显变化，说明AML患者存在细胞免疫功能失调。治疗缓解后的CR组与对照组比较无明显差别，说明经过系统化疗达完全缓解的CR组细胞免疫功能紊乱得到一定修复。研究发现，CD4+/CD8+比例未倒置的患者，经诱导缓解治疗阶段及移植后疗效均明显优于比例倒置患者[7]。此外，成熟淋巴细胞表达CD4+细胞和CD8+T细胞，而幼稚细胞不表达，因此混入的少量白血病细胞并不影响CD4+/CD8+的比例，具有较高的可信性。

DNT细胞（CD3+CD4-CD8-T）是一种抗原特异性免疫调节T淋巴细胞，具有免疫调节、免疫抑制作用[8]。本研究结果显示初发AML患者DNT细胞减少，可能导致肿瘤细胞凋亡作用降低致使肿瘤发病。

NK细胞（CD3-CD16+CD56+）是机体防御肿瘤的天然屏障，且CD56是唯一与髓外浸润相关的表面抗原，同时在白血病髓外浸润患者中高表达[9]。本研究结果显示初发组及CR组的CD16+CD56+细胞较对照组降低，说明初发AML患者NK细胞免疫功能明显受损，而CR后NK细胞免疫功能尚未完全恢复，这与文献报道基本一致[10]。

综上所述，初发AML患者淋巴细胞亚群明显异常，而随着疾病缓解，细胞数量及比例基本恢复正常，说明细胞免疫功能紊乱得到修复。因此检测淋巴细胞亚群，对AML患者免疫功能监测以及疗效、预后判断有一定的临床意义。另外DNT细胞下调免疫应答诱导移植物免疫耐受形成的作用也备受关注，而这种作用的证实仍将进行进一步的跟踪研究。

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[6] 贾国荣,李志芹.急性髓系白血病患者治疗前后T 淋巴细胞亚群测定的临床意义[J].免疫标记分析与临床,2011,18(2):76-79.

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[10] Luczyski W,Stasiak-Barmuta A,Kraw czuk-Rybak M,et al.Is cellular immunity not impaired after remission induction in children with acute lymphoblastic leukemia[J].Pol Merkur Lekarski,2004,16 (91):17-21.

Detection of Lymphocyte Subsets in Peripheral Blood of Patients with Acute Myeloid Leukemia and its Clinical Significance

ZHU Meng-xia, XU Lian-rong*, ZHANG Yao-fang
(Department of Hematology, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective To explore the expression and significance of the T cell subsets, DNT cells, NK cells in peripheral blood of patients with acute myeloid leukemia (AML). Methods The different level of peripheral blood T lymphocyte subsets, DNT cells, NK cells of 40 acute myeloid leukemia patients, 32 completely remitted (CR) patients and 20 normal controls were detected with flow cytometry. Results Compared with the normal controls , the percentage of CD4+cells, DNT cells, NK cells and the ratio of CD4+/ CD8+decreased obviously in newly diagnosed AML group (P＜0.05), while the change of percentage of CD3+cells and CD8+cells was not significant(P＞0.05). Compared with the normal controls the percentage of NK cells decreased obviously in CR group (P＜ 0.05).There was no significant difference in other data between CR group and the control group (P＞0105). Conclusion Lymphocyte subsets, DNT cells, NK cells were markedly changed in AML, but recovered essentially to normal after treatment. It shows that detection of T lymphocyte subsets, DNT cells, NK cells are clinically value on evaluation of therapeutic effect and prognosis of acute myeloid leukemia.

Leukemia, Myeloid, Acute; Lymphocyte subsets; Immune function

R733.71

B

1671-8194（2013）21-0032-02

*通信作者：E-mail：xulianrong@sohu.com