血管内皮生长因子在兔急性后腔静脉血栓形成中的表达及意义

王 晖，余朝文，李 博，王孝高，吴华东，李 春

(1蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233000;2成都医学院第一附属医院)

深静脉血栓形成是指血液在深静脉中不正常的凝结，多发于下肢，发病率有逐年上升趋势。但是，对于深静脉血栓形成过程中血管内皮生长因子(VEGF)的动态表达及临床应用研究的报道尚少。2012年10月～2013年1月，我们动态观察VEGF在家兔急性后腔静脉血栓形成后置管溶栓治疗过程中的变化，以便为VEGF联合基因转染治疗人类深静脉血栓形成提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料 健康成年新西兰白兔，雌雄不限，体质量2～2．5 kg(蚌埠医学院动物实验中心);兔抗人VEGF(北京博奥森生物科技有限公司)，注射用尿激酶(丽珠集团丽珠制药厂)，肝素钠注射液(天津生物化学制药有限公司)，碘伏醇注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 模型的建立及分组 健康成年新西兰白兔70只，随机分为3组:A组(实验组)30只、B组(实验对照组)30只、C组(空白对照组)10只。A、B组经耳缘静脉注射30%乌拉坦(5．0 mL/kg)，麻醉满意后取仰卧位，四肢外展固定，腹部备皮，2%碘伏手术区域消毒，铺无菌洞巾。取下腹部正中长约6cm切口，剪开后腹膜，暴露后腔静脉，游离左肾静脉以远长约6 cm的后腔静脉，以6-0丝线结扎沿途各属支。橡皮筋套扎后腔静脉近端及远端，30 min后松开后腔静脉远心端的橡皮筋;然后在后腔静脉近心端阻断处绕以丝线不完全结扎，使管腔缩窄至原周径的一半，然后松开近心端的橡皮筋，关闭后腹膜后缝合切口。术后当晚禁食，并每天给予青霉素80万U肌注，直至取标本前1 d。术后无动物死亡，A、B组术后第2天造影检查，可见后腔静脉局部双轨征，证实建模成功。A、B组建立兔后腔静脉血栓模型后，经股静脉置入微导管于后腔静脉。A组给予尿激酶500 U/(kg·h)、肝素钠 10 U/(kg·h)，微量泵持续泵入;B组给予等量生理盐水，微量泵持续泵入。C组不做任何处理。

1．2．2 后腔静脉管腔VEGF表达检测 分别于用药后第1、4、7天，随机从A、B组取出10只兔子，切取血栓形成的后腔静脉，去除血栓，用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm，行苏木素伊红染色。C组于第7天取材，方法同上。后腔静脉管腔VEGF表达检测采用免疫组化法。切片脱水后，3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min，置标本于抗原修复液中(37℃)2 min，依次滴加山羊血清封闭液、一抗、二抗、SABC试剂，显色、脱水、透明，中性树胶封片观察。VEGF以胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。VEGF阳性判断方法:每例随机观察5个视野(左上、右上、右下、左下、中央)，每个视野100个细胞，计算500个细胞中染色阳性细胞的百分比。

1．2．3 统计学方法 采用SPSS19．0统计软件，计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

VEGF表达主要见于内皮细胞、单核细胞、血栓中的纤维梭形细胞胞质中，正常静脉壁VEGF可见少量表达。与C组比较，A、B组第1、4、7天，VEGF表达持续升高(P均＜0．05)。A组与B组VEGF表达在血栓后各时间段均有统计学差异(P均＜0．05)。见表1。

表1 三组不同时间VEGF表达情况(%，¯x±s)

3 讨论

深静脉血栓形成是一种多基因、多因素疾病，由于发病率、致残率及致死率均较高，该问题一直备受医学界重视［1］。在血栓治疗中，传统治疗方法为药物抗凝溶栓或手术取栓，前者又分为全身用药和局部用药。局部用药可以使药物在局部浓度达到最大值，发挥其最大效用，并能减少全身用药可能出现的危险，是目前血栓治疗较合理的选择。国内外大量的文献发现，现有的各种治疗深静脉血栓的方法对患者远期并发症的发生率改变并不大［2～5］。随着基因技术的深入开展，部分学者发现bFGF、VEGF对血管生成、创伤愈合和组织损伤修复有较大作用［6～8］。有研究显示，血栓溶解自然过程与伤口愈合相类似。

VEGF是血小板源生长因子超家族成员，可由多种细胞产生和分泌，在生理和病理情况下均可促进血管增生和调节血管通透性。Waltham等［9］发现VEGF和bFGF在大鼠的后腔静脉自然溶解血栓中存在表达，并能调节血栓的再通和机化，而血清中VEGF和bFGF水平变化不明显。Waltham等［10］通过静脉注射VEGF治疗静脉血栓发现，VEGF可促进管腔再通、血栓机化和单核细胞迁移至血栓中心。Takayuki利用新西兰白兔股动脉球囊损伤的模型行基因转移，实验组给予 phVEGF165，对照组给予pGSVLacZ，实验组血栓阻塞发生率为3．1%，对照组为21．9%，两组比较有统计学意义;处死兔子行尸检发现附壁血栓的发生率实验组较对照组低(15%vs 36%，P＜0．05)。本研究表明，在血栓形成段静脉血管壁内皮细胞中VEGF有明显表达，与文献报道相同，并且随着时间进展，表达进一步加强，表明VEGF在血栓机化或溶解中起到一定的作用。本研究中，给予肝素和尿激酶处理动物较未处理动物VEGF表达显著提高，表明肝素和(或)尿激酶能增强 VEGF 的表达［11，12］。

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