针灸对阿尔茨海默病模型大鼠海马神经元线粒体中亲环蛋白D的影响

罗磊,杜艳军,孙国杰



针灸对阿尔茨海默病模型大鼠海马神经元线粒体中亲环蛋白D的影响

罗磊,杜艳军,孙国杰

(湖北中医药大学,武汉 430065)

运用定量RT-PCR法观察针灸对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马神经元线粒体中亲环蛋白D(CypD)基因表达的影响,探讨针灸防治AD的具体作用机制。运用大鼠海马注射Ab1-42的模型复制方法,将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和针灸组,采用针刺加灸百会和肾俞穴的治疗方法,通过定量RT-PCR法检测AD模型大鼠海马神经元线粒体中CypD mRNA的表达水平。大鼠行为学观察可见针灸组大鼠进食饮水量正常,对外界刺激反应尚可,较模型组有所改善,同时通过对大鼠海马神经元线粒体中CypD基因表达的扩增倍数统计学分析发现,模型组大鼠海马神经元线粒体中CypD的表达明显高于正常组和假手术组(＜0.01),而针灸组表达明显低于模型组(＜0.05),提示针灸能够有效抑制海马神经元线粒体中CypD的过度表达,从而改善海马神经元线粒体膜内外渗透失衡,减轻线粒体损伤。针灸防治AD可能与其抑制大鼠海马神经元线粒体中CypD的过度表达,阻滞mPTP形成并改善线粒体的损伤有关。

针灸疗法;阿尔茨海默病;大鼠;RT-PCR;CypD

阿尔茨海默病(Alzhemier’s disease,AD)是一种常见的神经系统退行性疾病,已成为继心脏病、肿瘤、中风后的人类第四大杀手。临床主要特征为进行性认知功能障碍及记忆力减退。b淀粉样多肽(amyloid-bpeptide,Ab)在细胞内外沉积及线粒体异常改变均为AD的重要病理特征[1],其中线粒体损伤不仅是AD发病过程中的早起事件,且随着AD病情的进展,神经元线粒体断裂也随之加重[2-3]。同时线粒体损伤机制不仅与其超微结构发生变化有关,电镜下可见神经元胞质中线粒体数量明显变少,结构不清,出现了明显的肿胀,空泡样变化,嵴断裂,结构模糊;而且可能与线粒体能量代谢途径、线粒体动力学异常途径、线粒体通透性转化孔(mPTP)开放途径等密切相关。本课题通过定量RT-PCR(Quantitative RT-PCR,Q-RT-PCR)技术观察针灸对线粒体通透性转换孔mPTP的必需成分之一,即亲环蛋白D(Cyclophilin D,CypD)的影响,以期揭示针灸防治AD的具体作用机制,为临床治疗提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

Wistar大鼠,SPF级、雄性、体重(200±20)g,20只,由湖北省实验动物研究中心提供[许可证号SCXK(鄂)2008-0005]。实验前所有大鼠置于鼠笼常规适应性喂养1星期;实验时,参照文献[4],经Morris水迷宫测试筛选,剔除不符合评定标准的大鼠后按编号表随机分为正常组、模型组、假手术组和针灸组,每组5只,分笼饲养,并用苦味酸给予染色标记编号,整个实验过程遵守动物伦理学规定。

1.2 主要试剂与仪器

AmyloidbProtein Fragment 1-42(美国sigma公司);大鼠脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司); Total RNA提取试剂(Invitrogen Life Technologies, 15596-026);定量PCR试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司);PCR仪(Hangzhou Bioer Teechnology Co,LTD); Morris水迷宫(MT-200Morris水迷宫视频跟踪系统,成都泰盟);荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司);高速冷冻离心机(Heal Force);美容艾条(f=0.6 cm,南阳汉医艾绒有限公司)。

1.3 动物模型的复制

实验用大鼠置于安静清洁环境下,分笼喂养,温度控制在(24±2)℃,定时给予充足清洁饮水和定量大鼠专用饲料。适应性喂养1星期后,无不良反应,饮食、饮水正常者,参照文献[4],开始进行Morris水迷宫测试筛选,剔除不符合评定标准的大鼠。评定后的合格大鼠进行称重,用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于手术台上,使用大鼠脑立体定位仪固定头部。无菌环境下,颅顶区备皮,剥开皮下筋膜暴露顶骨,进行手术区皮肤消毒,于两侧冠状缝后钻出小孔,取出碎骨屑,保持硬脑膜的完整。按照大鼠脑立体定位图谱[5]选择大鼠海马区域用微量注射器缓慢将药物Ab1-42(5mL)注入海马(前囟后3.3 mm,中线左右各旁开1.5 mm,深度3 mm),5 min内注完,注射后留针5 min,按1.0 mm/min速度缓慢出针,以免拔针时药物溢出。术后牙托粉封固颅骨孔,缝合皮肤,3 d内每日肌注青霉素G10万U防止感染,并进行模型评价剔除不合格者。

1.4 处理方法

正常组经筛选合格后于(24±2)℃室温中常规饲养,定时给予充足清洁饮水和定量大鼠专用饲料,不进行任何处理,作为实验对照组;模型组模型复制成功后不予任何处理;假手术组颅内注射等量生理盐水,具体方法同模型组,不进行任何处理;针灸组于实验第3天模型复制成功后(具体方法同模型组),根据华兴邦提供的大鼠穴位定位方法,定位大鼠百会(顶骨正中)和肾俞(第2腰椎下两旁)穴,先针刺百会(向前平刺3～5 mm),肾俞穴(稍向内斜刺5 mm)15 min,然后用美容艾条(f=0.6 cm),于百会和肾俞穴位上方2～3 cm处进行悬灸,使穴位表皮温度在(43±1)℃,持续15 min,每日1次,7 d为1个疗程,共计2个疗程,疗程间休息1 d。

1.5 标本采集

各组大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(300 mg/kg),断头取脑,迅速在冰盘上剥离脑膜,除去嗅球、延髓和小脑,分离双侧海马,置于冰箱﹣80℃冻存备用。

1.6 定量RT-PCR法检测大脑海马线粒体中Cyp D的表达

1.6.1 引物的设计

通过NCBI查找大鼠CypD基因序列,应用Primer Primers软件进行引物设计。同样设计b-actin为内参照,引物由Invitrogen Biotechnology Co,LTD中国公司合成。

CypD引物序列(扩增产物为268 bp),上游5'-TTCCATCTTATGCTCTTCACCG-3';下游5'-GGTTGAAGAAGTCCTTGTCTGC-3'。内参照b-actin引物序列(扩增产物为110bp),上游5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3';下游5'- TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'。

1.6.2 脑组织总RNA的提取

①大鼠活体迅速取出大脑海马部位的脑组织100 mg,加入1 mL Trizol Reagent冰浴匀浆研磨至无可见组织块,移至1.5 mL EP管中;②加入250mL三氯甲烷,颠倒离心管15 s,充分混匀,静置3 min,4℃下13000 r/min离心8 min,分层后,取上清液至新的1.5 mL EP管中;③加﹣20℃预冷的0.8倍体积的异丙醇,颠倒混匀,静置15 min,4℃下13000 r/min离心10 min,管底的白色沉淀即为RNA;④弃上清,加预冷的75%乙醇1.5 mL洗涤沉淀,4℃下13000 r/min离心5 min;⑤倒弃上清,滤纸吸干,将离心管置于超净台上吹3 min,加入20mL无RNA酶的水溶解RNA。整个实验过程中枪头和离心管均经过湿热灭菌20 min后干燥,无RNA酶。

1.6.3 反转录

①以Oligo(dT)15 1mL为引物,加入含2mgRNA的溶液,用无核糖核酸酶的去离子水补足至12mL,于PCR仪上70℃保温5 min,迅速置冰上冷却;②依次加入4mL 5×buffer,2mL 10 mM dNTPs,1mL RNA inhibitor和1mL反转录酶,用枪抽吸混匀,于PCR仪上42℃保温30 min,结束后80℃保温5 min灭活反转录酶。整个实验过程中枪头和PCR均经过湿热灭菌20 min后干燥,无RNA酶。

1.6.4 PCR扩增

①取0.2 mL PCR管,配制下列反应体系,每个反转录产物配制3管,2×qPCR Mix 12.5mL;2.5mM基因引物2.0mL;反转录产物2.0mL;ddH2O 8.5mL;②另取0.2 mL PCR管,配制下列反应体系,每个反转录产物配制3管,2×qPCR Mix 12.5mL;2.5mM内标引物2.0mL;反转录产物2.0mL;ddH2O 8.5mL;③反应条件,95℃预变性1 min,95℃变性15 s,72℃退火20 s,共40个循环,72℃末段延伸5 min;对CypD定时PCR产物制作溶解曲线,先将PCR产物升温至95℃,15 s后降温至58℃,维持20 s后再升温至72℃维持20 s,72℃→95℃,每20 s升温1℃。在此整个过程中连续收集荧光信号,然后绘制熔解曲线并进行特异性分析。

1.6.5 结果处理

以扩增倍数作为比较依据,采用ΔΔCT法进行结果计算,即A=CT(目的基因,实验样本)－CT(内标基因,实验样本);B=CT(目的基因,对照样本)－CT(内标基因,对照样本);K=A－B;表达倍数=2﹣K,计算结果运用SPESS17.0进行统计学分析。

2 结果

2.1 大鼠行为学检测

实验前各组大鼠经Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)筛选,剔除不合格大鼠;实验过程中观察可见模型组大鼠进食饮水量有所减少,毛发光泽度降低,部分可见脱毛伴行动迟缓,对外界刺激降低,而针灸组大鼠进食饮水量正常,对外界刺激反应尚可,较模型组有所改善;实验过程中运用Morris水迷宫测试大鼠在实验中逃避潜伏期的长短及跨越原平台位置的次数,观察各组大鼠的学习和记忆能力。其中定位航行试验(place navigation)历时数天,每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点(N、E、S、W)放入水中若干次,记录其寻找到隐藏在水面下平台的情况,即为逃避潜伏期;然后进行空间探索试验(spatial probe)即在定位航行试验后去除平台,任选一个入水点将大鼠放入水池中,记录其在一定时间内的游泳轨迹,观察各组大鼠对原平台的记忆能力,即为跨越原平台次数和有效区停留时间。由表1可见,定位航行试验中模型组的平均逃避潜伏期较长,而空间探索实验中的跨越原平台次数和有效区停留时间较短,与正常组和假手术组相比具有极显著性差异(＜0.01),提示模型组大鼠学习记忆能力出现明显的减退,模型复制成功;而经过15 d针灸治疗后,能够有效改善大鼠的学习记忆能力,与模型组相比具有统计学意义(＜0.01),提示针灸能够有效减轻Ab1-42的神经毒性作用,恢复大鼠正常的学习记忆能力,在行为学上有着明显的改善。

表1 各组大鼠Morris水迷宫结果比较 (±s)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.2 大鼠海马神经元线粒体中CypD结果分析

运用定量RT-PCR法进行检测,其中实时PCR熔解曲线可见PCR扩增特异性强,提示无明显的引物二聚体或其他非特异性杂带出现。PCR扩增期间,将检测临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点值处,即Ct值,采用ΔΔCT法计算扩增表达倍数,并将扩增倍数通过统计学分析(见图1)。模型组表达比正常组和假手术组明显增高,具有极显著性差异(＜0.01),提示老年性痴呆发病过程中可能与CypD的过度表达,海马神经元线粒体膜内外渗透失衡导致线粒体损伤有关;而针灸组CypD的表达明显降低,与模型组比较差异亦存在统计学意义(＜0.05),提示针灸治疗老年性痴呆过程中,可能与其抑制海马神经元线粒体中CypD的过度表达,阻滞mPTP的形成,从而改善海马神经元线粒体膜内外渗透失衡,减轻线粒体损伤有关。

与正常组比* P＜0.05,**P＜0.01;与模型组比#P＜0.05,##P＜0.01

3 讨论

老年性痴呆属于中医学“呆证”、“郁证”、“善忘”、“癫狂”、“不慧”、“愚痴”等范畴。明代《景岳全书》第一次提出痴呆是独立性疾病。现代医学认为老年性痴呆是中枢神经系统的一种原发性退行性变性疾病,临床主要表现为记忆、认知、语言、行为障碍及人格改变,病久可丧失生活自理能力,给家庭、社会造成极大负担[6-7]。AD患者大脑皮质弥散性萎缩,神经元丢失,突触减少,Ab沉积形成老年斑(senile plaque,SP)和细胞内tau蛋白异常磷酸化导致神经原纤维缠结(neuro-fibrillarytangle,NFT)形成是其特征性病理变化。尽管引起AD的病因有很多,其中关于线粒体的损伤相关机制研究备受关注[8]。mPTP是线粒体膜渗透转换功能的结构基础,它是位于线粒体内外膜之间由多个蛋白质组成的复合通道,又称为线粒体大通道(megachanel)。mPTP的开放会导致线粒体膜通透性的转变,而线粒体膜的通透化与神经细胞凋亡存在密切关系,是线粒体损伤机制中三大主要途径之一。同时,线粒体基质内的CypD是组成线粒体通透性转换孔mPTP的必需成分之一,其与内膜上的分子磷酸载体结合是mPTP形成的启动过程。研究显示[9-11],AD患者Ab沉积的线粒体中CypD表达可见显著提高,并且可特异性结合形成Ab-CypD复合物,从而促进mPTP开放,导致线粒体膜内外渗透失衡引起功能障碍。而CypD阻滞剂环孢素A(cyclos porine A)可阻滞mPTP形成并改善其对线粒体和细胞的损伤,故CypD在Ab促进mPTP开放中起到重要的作用。

本研究从AD的病因病机出发,以“益肾调督”为主要治疗原则,重点选择百会、肾俞(双侧)穴治疗该病。百会又名三阳五会,乃督脉与足太阳、手少阳、足少阳、足厥阴等经脉交会处,具醒神开窍、补脑益智之功;肾俞穴为足太阳膀胱经之背俞穴,是肾精之气转输、汇集于背腰部之处,而且足太阳经经气与督脉互通,共主一身之阳气,该穴不仅补益肾气肾精,而且还调节督脉经气,经气通畅,使肾生髓,源源不断上注于脑,髓海充足,则元神恢复,二穴共用可起到益肾调督之功。从研究结果可以看出,模型组海马神经元线粒体中CypD的表达明显高于正常组和假手术组(＜0.01),可见在AD的发病过程中CypD的过度表达可导致mPTP的开放,从而引起线粒体膜内外渗透失衡,导致线粒体损伤促进细胞外b淀粉样蛋白的沉积和老年斑的形成;通过针灸治疗后,CypD的表达明显下降(＜0.05),提示针灸治疗能够有效抑制CypD的过度表达,阻滞mPTP形成并改善线粒体的损伤,达到防治AD的目的。当然,线粒体损伤机制不仅与线粒体通透性转换孔有关,还与线粒体能量代谢途径和线粒体动力学异常途径有关,至于针灸对另外两大途径的影响仍有待进一步研究。

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Effects of Acupuncture and Moxibustion on Mitochondrial Cyclophilin D in Hippocampal Neurons in A Rat Model of Alzheimer Disease

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,430065,

To explore the mechanism of preventive and therapeutic actions of acupuncture and moxibustion on Alzheimer disease (AD) by using quantitative RT-PCR to investigate their effects on the expression of cyclophilin D (CypD) gene in hippocampal neuronal mitochondria in a rat model of AD.The rat model was made by injecting Ab1-42 into the hippocampus. Rats were randomly allocated to normal, sham operation, model and acupuncture -moxibustion groups. Acupuncture at and moxibustion on points Baihui (GV20) and Shenshu (BL23) were performed for treatment. The level of CypD mRNA expression in hippocampal neuronal mitochondria was measured using quantitative RT-PCR in a rat model of AD.The observation of rat behaviors found that in the acupuncture -moxibustion group of rats, food and water intakes were normal, and responses to external stimuli existed and improved somewhat compared with the model group. Statistical analysis of the expansion fold of CypD gene expression in rat hippocampal neuronal mitochondria showed that CypD expression in hippocampal neuronal mitochondria was significantly higher in the model group of rats than in the normal and sham operation groups (＜0.01) and significantly lower in acupuncture -moxibustion group than in the model group (＜0.05), suggesting that acupuncture and moxibustion could effectively inhibit CypD overexpression in hippocampal neuronal mitochondria to improve an inside-outside imbalance in mitochondrial membrane permeability and reduce injury to mitochondria in hippocampal neurons.Acupuncture–moxibustion prevention and treatment of AD may be related to its inhibiting CypD overexpression in mitochondria, checking mPTP formation and reducing injury to mitochondria in rat hippocampal neurons.

Acupuncture-moxibustion therapy; Alzheimer disease; Rats; RT-PCR; CypD

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.12.1056

1005-0957(2013)12-1056-04

国家自然科学基金项目(81173323,81273864)

罗磊(1983 - ),男,2011级博士生

杜艳军(1975 - ),女,副教授,博士

2013-05-20