蟾蜍灵对白血病K562细胞生长抑制机制

贾彩云，王艳鸽，呼文亮，马远方

（1.河南大学 免疫学研究所，河南 开封 475004；2.武警医学院 生物化学教研室，天津 300612）

近年来研究［1］发现，含有蟾蜍毒素成分的中药复合制剂在体外能抑制多种肿瘤细胞生长，诱导白血病的分化。临床观察提示，含蟾蜍毒素的中药制剂对肝癌、肺癌、食管癌、直肠癌及白血病等有明显的抑制作用。Numazawa等［2］研究表明，蟾蜍毒素的各种成分以剂量依赖诱导白血病K562细胞分化。在所有的蟾蜍毒素中，蟾蜍灵是诱导白血病细胞分化最有效的成分。蟾蜍灵在较低浓度（1×10－8～1×10－9mol／L）能够在较宽的范围内（有较宽的白血病谱）引起人白血病的分化［3］，在较高的浓度（≥1×10－7mol／L）诱导人白血病细胞凋亡［3］。我们的实验以蟾蜍灵单体作用K562细胞株，研究其抑制白血病细胞生长和凋亡作用。

1 资料和方法

1.1 试剂

蟾蜍灵购自天津药物研究所，用无水乙醇配成1mol／L的贮存液，使用前用完全培养基稀释到所需浓度；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国sigma公司产品；TUNEL（末端转移酶介导的缺口末端标记法）凋亡试剂盒为德国Roche 公司产品；Trizol为美国Gibco BRL 公司产品；RT－PCR 试剂盒为大连宝生物公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株和细胞培养

K562（人髓性白血病细胞株）细胞由天津市血液病研究院惠赠。K562 细胞用内含体积分数为10%的灭活胎牛血清、80U／mL的庆大霉素、20mmol／L HEPEs、质量分数为0.2% NaHCO3、质量分数为0.01%L－谷氨酰胺的RPMI 1640 培养基培养。

1.3 倒置光显微镜下细胞形态学变化

分别计数不同时间点对照组和处理组（1.00μmol／L）活细胞数，每个时间点每组细胞各计数3次，取其平均值。

1.4 荧光显微镜下细胞形态学变化

分别收集对照组和处理组细胞2×106个，PBS磷酸盐缓冲液重悬，加入Hoechst 33342／PI（1∶1）的染液，37℃孵育8min，离心，弃上清，PBS磷酸盐缓冲液50μL重悬，涂片，荧光显微镜下观察、记录并照相。正常细胞、凋亡细胞着色为蓝色，死亡细胞着色为红色。细胞记数依据上述特点，取连续4个视野，每个视野细胞记数不少于80个。

1.5 透射电镜观察细胞超微结构的变化

收集对照组和处理组（1.00μmol／L）K562细胞2×106个，用预冷体积分数为2%的戊二醛磷酸缓冲液（pH 7.3）先固定12h，质量分数为1%的锇酸后固定2h。乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀－柠檬酸铅双染，在透射电镜下观察并摄像记录。

1.6 MTT 实验

取对数增长期细胞，稀释至1×105／mL，接种96孔板，每孔0.1mL，24h后加入不同浓度的蟾蜍灵，以未经蟾蜍灵作用K562细胞和单纯的培养液作为阴性对照。每种浓度8个复孔，继续培养72h，加入MTT（5g／L），继续培养4～5h，离心，弃上清，加入DMSO，避光震荡约10min。用自动酶标检测仪在570nm 处检测96孔板的光吸收值（A570值）。细胞增殖抑制率（%）＝（A阴性对照－A实验组）／（A阴性对照－A空白对照）×100%。

1.7 琼脂糖凝胶电泳分析DNA 片段

用抽提的方法分别提取处理组及对照组K562细胞的DNA，10g／L 琼脂糖凝胶电泳3～4h，电压75V，紫外灯下观察并照相。

1.8 细胞周期分析

体积分数为75% 预冷乙醇固定K562 细胞5×106个，加入PI，避光染色30min，流式细胞仪测定细胞周期，用SSC和FSC 两个参数选取细胞，用PI荧光强度测定DNA 含量，分析G1期、S期、G2期细胞的比例以及亚二倍体峰的DNA的含量。

1.9 统计分析

数据输入Excel进行管理，采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。MTT 实验各组间的差异采用方差分析（Post－Hoc LSD 法），组间凋亡率的差异采用卡方检验，取P＜0.05作为显著性差异的界值。

2 结果

2.1 倒置光显微镜下细胞的形态学变化

倒置光显微镜下，对照组K562细胞呈悬浮性生长，圆形，透明，折光性好，大小均一，形态一致。蟾蜍灵组K562细胞，细胞悬浮性增高，透明度下降，细胞中出现空泡，并有膜包裹的凋亡小体。见图1。

2.2 Heochst 33342／PI结果

对照组K562 细胞大小一致，荧光均匀，荧光相对较淡。蟾蜍灵各处理组K562细胞出现典型的凋亡形态学改变，细胞体积变小，胞浆浓缩、核固缩、核裂解、凝集染色质荧光强度增强，并有膜包裹的凋亡小体形成。见图2。计算各处理的凋亡率，结果显示，0.10、1.00和10.00μmol／L蟾蜍灵作用K562细胞24h，细胞的凋亡率分别为17.68%、62.74%和88.97%。随着浓度的升高，凋亡率升高，统计分析结果显示，各组间差异显著（P＜0.01）。可见蟾蜍灵可在较短时间内引起K562细胞明显凋亡。

2.3 电子透射显微镜观察结果

对照组K562细胞形态比较规则，胞浆内线粒体丰富，分布无规律，排列紊乱；核圆形或椭圆形，核膜清楚，核内染色质分布均匀，电子密度一致。1.00μmol／L的蟾蜍灵处理K562细胞24h，细胞体积缩小，胞核胞浆比减小，胞膜尚完整，核染色质已聚集在核膜下，呈现典型的新月形核凋亡细胞，其余核区电子密度较低。见图3。

图1 加药前后光镜下K562细胞形态学改变（×100）

图2 加药前后荧光显微镜下K562细胞形态学改变（×200）

图3 加药前后电子显微镜下K562细胞形态学改变（×4500）

2.4 蟾蜍灵抑制K562细胞生长结果

蟾蜍灵可抑制白血病K562细胞的生长，与对照组相比，各浓度组均能显著抑制白血病K562细胞的生长（P＜0.01）。蟾蜍灵对K562 细胞的半数抑制浓度（IC50）约为0.013μmol／L，且蟾蜍灵的生长抑制作用呈时间剂量依赖性，各组间两两比较差异显著（P＜0.01）。实验结果显示，在0.001～1.000μmol／L蟾蜍灵均能抑制K562细胞生长。见表1。

表1 蟾蜍灵对K562细胞的生长抑制作用（，n＝6）

2.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果

0.10、1.00μmol／L和10.00μmol／L 蟾蜍灵作用K562细胞24h，结果显示对照组没有出现梯状带，1.00μmol／L和10.00μmol／L 组出现典型的梯状带。见图4。

2.6 细胞周期分析结果

0.10μmol／L蟾蜍灵作用12h可将K562细胞周期阻滞在G2／M 期，作用24h，K562 细胞G2／M期数量并未明显增加，但凋亡细胞数增加至14.9%，凋亡细胞数量明显增加，出现典型的亚G1峰。见表2、图5。

图4 蟾蜍灵作用下，K562细胞DNA 在电泳上形成梯状带

表2 0.10μmol／L蟾蜍灵对K562细胞周期分布及凋亡的影响（%）

图5 K562细胞的流式细胞图

3 讨论

实验采用MTT 法进行药敏试验判定蟾蜍灵在体外对人髓性白血病K562细胞是否确切有抗增殖作用。结果表明，蟾蜍灵在0.001μmol／L 即可明显地抑制人髓性白血病K562细胞的生长（P＜0.01），增加蟾蜍灵浓度抑制作用更加明显（P＜0.01）。由此可以得出，人髓性白血病K562细胞对蟾蜍灵敏感性良好。与以前的报道［4－5］相一致，即蟾蜍灵以时间剂量依赖形式抑制急性早幼粒性白血病NB4细胞生长并诱导其凋亡，能够抑制人单核细胞白血病细胞TPH－1细胞生长并诱导其分化。

已有研究［6－7］表明，蟾蜍灵能够引起HL60细胞和U937细胞凋亡。我们研究说明，蟾蜍灵可诱导人K562细胞凋亡，且呈时间和剂量依赖关系。用1.00μmol／L蟾蜍灵作用K562细胞24h，在倒置光相差显微镜下观察到细胞中出现小泡，随即降解消失；荧光双染显示染色质凝集、断裂、凋亡小体形成。透射电镜结果显示，细胞体积缩小，胞核胞浆比减小，胞膜尚完整，核染色质已聚集在核膜下，呈现典型的新月形核凋亡细胞，其余核区电子密度较低。由蟾蜍灵处理的细胞中提取的DNA 琼脂糖凝胶电泳的结果，出现典型核酸断裂的梯状带，被认为是程序性细胞死亡的早期事件，表明蟾蜍灵能以剂量和时间依赖关系诱导人白血病K562凋亡。此结论与以前的报道［7］相一致。尽管蟾蜍灵能够诱导人白血病细胞凋亡，但即使在较高浓度（10－6mol／L）下，也未能观察到蟾蜍灵诱导人正常血液中单核细胞和多形核细胞凋亡。

我们的实验发现，0.10μmol／L 蟾蜍灵可明显阻滞K562细胞于G2／M 期，该效应呈明显的时间依赖关系。此外，K562细胞的G2／M 期阻滞在12h内就很明显，而此时无论是荧光染色还是流式细胞术检测，都仅有少量细胞发生凋亡。随着时间延长，才能检测到明显的细胞凋亡。而细胞周期的阻滞作用无明显升高，说明细胞周期的阻滞抑制了细胞生长，最终引起细胞凋亡。

蟾蜍灵最可能的膜受体为Na＋－K＋ATP酶，因为在各种肿瘤细胞的细胞膜上，该酶的活性可被蟾蜍灵抑制。蟾蜍灵对人肿瘤细胞的特异作用可归因于人细胞膜上Na＋－K＋ATP 酶［8］的特异结构。抗凋亡基因survivin［9］表达检测有望进一步阐述蟾蜍灵抑制白血病细胞生长的分子机制。

［1］Yin p H，Liu X，Qiu Y Y，et al.Anti－tumor activity and apoptosis－regulation mechanisms of bufalin in various cancers：new hope for cancer patients［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（11）：5339－5343.

［2］Numazawa S，Shinoki M，Ito H，et al.Involoement of Na＋－K＋ATPase inhibitiog in K562cell differentiation induced by bufallin［J］.J Cell Physiol，1994，160（1）：113－120.

［3］Efferth T，Davev M，Ocbrich A，et al.Activity of drugs from traditional Chinese medicine toward sensitive and MDR1－or MRP1－overexpressing multidrug－resistant human CCRF－CEM leukemia cells［J］.Blood Cells Mol Dis，2002，28（2）：160－168.

［4］Zhu Z，Li E，Liu Y，et al.Bufalin induces the apoptosis of acute promyelocytic leukemia cells via the downregulation of survivin expression［J］.Acta Haematol，2012，128（3）：144－150.

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［6］Jing Y，Ohizum H，Kawazoe N，et al.Seiective Inhibitory Effect of Bufalin on Growth of Human Tuman Cells in vitro：Association with the Induction of Apoptpsis in Leukemia HL－60Cells［J］.Jpn J Cancer Res，1994，85（6）：645－651.

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［8］Kawazoe N，Aiachi T，Masuda Y，et al.Induction of apoptosis by bufalin in human tumor cells is associated with a change of intracellular concentration of Na＋ions［J］.J Biochem，1999，126（2）：278－286.

［9］于庆凯，付怀平，马杰.抗凋亡基因survivin在60例大肠癌中的表达及意义［J］.河南大学学报：医学版，2006，25（1）：40－42.