miR-15a 和miR-16-1 在弥漫性大B 细胞淋巴瘤中的表达及意义*

徐 晓 欧阳卫泽 郑美蓉，2

(1 九江学院临床医学院/附属医院; 2 九江学院基础医学院 江西九江 332000)

弥漫性大B 细胞淋巴瘤(diffuse large B -cell lymphoma，DLBCL)是最常见的一类非霍奇金淋巴瘤，在临床特征、形态学表现、免疫表型和分子遗传学等方面具有异质性［1］。MicroRNA 是近来发现的一类调节基因表达的非编码RNA。成熟miRNA 大约19 -25nt (核苷酸)，由70 -100nt(核苷酸)pre-miRNA 剪切而来，成熟miRNA 通过和靶基因mRNA 碱基配对引导沉默复合体(RNA - induced silencing complex，RISC)降解mRNA 或阻碍其翻译，在转录后水平调控靶基因的表达［2］。miR -15a、miR -16 -1 属于MicroRNA的两个成员。2002年，Calin 等发现miR -15a和miR-16 -1 定位于人染色体13q14.3的区域内，而这一区域在50%的慢性淋巴细胞白血病(CLL)病人中缺失［2］。Cimmino 等研究发现miR-15a 和miR -16 -1 两者5’末端的前九个核苷酸与BCL2cDNA 第3287 至3279 之间的碱基互补。在慢性淋巴细胞白血病，miR-15a 和miR-16 -1都能直接与BCL2mRNA的3’UTR 作用，在转录后水平负向调控BCL -2的表达［3］。BCL -2 蛋白的表达与DLBCL的不良预后有关，miR -15a 和miR-16 -1 是否与DLBCL 中BCL-2 蛋白表达有关，现将笔者研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本

收集九江学院附属医院病理科2005 ～2010年DLBCL 石蜡标本30≥，随机选取反应性增生的淋巴结10≥作为对照。收集患者临床病理资料，所有组织标本均经10%的福尔马林固定，石蜡包埋。所有组织切片均由两名高级职称病理医师复审并确诊，按照2008年WHO 造血与淋巴组织肿瘤病理学标准进行形态学和免疫表型分型［1］。

1.2 石蜡组织中提取RNA 及RT-PCR

应用miRNeasy FFPE Kit (QIAGEN 公司)试剂盒提取石蜡组织中的总RNA。cDNA 合成反应体系:100mmol/L dNTPs 0.2μL，1.5μL 逆转录酶，逆转录Buffer1.5μL，RNA 酶抑制剂0.2μL，无RNA 酶水4.5μL，3μL 引物和5μLRNA 样本，扩增条件如下:16℃30min，42℃30min，85℃5min，将miR-15a 和miR -16 -1 逆转录为cDNA，-20℃保存。miR -15a 和miR -16 -1 逆转录引物序列、Real -time 引物序列和Taqman 探针序列见表1［4］。

表1 miR-15a 和miR-16 -1 引物序列

1.3 荧光实时定量PCR

反应体系总体积为30μL，含cDNA1.35μL，引物及探针Mix (20 ×，ABI 公司)1μL，TaqMan通用混合物(2 ×，ABI 公司)20μL，无核酸酶水7.65μL。在荧光定量PCR 仪上进行实时定量PCR检测，每个样本重复3 次，扩增条件为94℃5min，94℃15s、60℃40s，40个循环，软件分析其Ct值。用U6 作为内参，结果以相对CT 值表示。

1.4 免疫组织化学染色

采用MaxVision 两步法检测DLBCL 中Ki-67、Bcl-2的表达情况。两种抗体均购自福州迈新生物技术有限公司。采用PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照。结果判定:Ki -67 阳性表达率＜50%记为(-)，≥50%记为(+)。Bcl -2 阳性肿瘤细胞百分率≥30% 记为 (+ )， ＜30% 记为(-)。

1.5 数据分析

采用SPSS13.0 统计软件包进行统计学处理，计量资料采用均数±标准误(x ± s)表示，miR-15a 和miR-16 -1 在两组之间表达的比较采用t检验。

2 结果

2.1 miR-15a 和miR -16 -1 在弥漫性大B 细胞淋巴瘤中的表达

DLBCL 组及反应性增生淋巴结组miR -15a表达分别为2.81 ～22.65 (5.45 ±0.79)和3.12～28.17 (8.31 ±0.85);两组miR-16 -1 表达分别为1.78 ～24.57 (4.56 ±0.87)和2.56 ～29.43(7.47 ±1.02)，miR -15a 和miR -16 -1 在肿瘤组织中较正常组织低表达(p＜0.05)。所有DLBCL 病例通过CD10、Bcl -6、MUM -1 免疫标记进行分类，免疫组化结果显示11≥(36.7%)为GC 型DLBCL，19≥(63.3%)为非GC 型DLBCL。miR-15a 和miR -16 -1 表达量在GC 型DLBCL 和非GC 型DLBCL 组之间差异无统计学意义(详见表2)。

表2 DLBCL 中miR-15a、miR-16 -1的表达与各参数之间的关系(CT 值，x±s)

2.2 miR-15a、miR-16 -1的表达与Ki-67、bcl-2 表达的相关性

30≥DLBCL 中有13≥表达bcl - 2 (占43.3%，图1)，17≥Ki-67≥50% (占56.7%，图2)。miR-15a、miR-16 -1 表达水平与bcl-2蛋白表达、高增殖指数(Ki -67≥50%)呈负相关。

图1 DLBCL，Bcl-2 在肿瘤细胞膜和胞质阳性表达(EnVision 法 ×400)

图2 DLBCL，Ki-67 在肿瘤细胞核阳性表达(EnVision 法 ×400)

3 讨论

miRNA的主要功能是调节生物体内在与机体生长、发育、疾病发生过程有关基因的表达。越来越多的证据表明，miRNA 在造血细胞分化发育、免疫细胞功能调节和肿瘤发生方面发挥着重要的作用［2］。国外多项研究表明，MicroRNA 可以作为原癌基因或抑癌基因影响肿瘤的形成。本研究表明miR-15a 和miR-16 -1 在DLBCL 组较反应性增生的淋巴结组表达下降，与Eis 等［5］的研究结果相同。miR-15a 和miR -16 -1 在DLBCL 中表达的下降是否影响肿瘤的形成?Cimmino 等研究发现miR-15a 和miR-16 -1 两者5’末端的前9个核苷酸与BCL2cDNA 第3287 至3279 之间的碱基互补。在慢性淋巴细胞白血病，miR -15a 和miR-16 -1 都能直接与BCL2mRNA的3’UTR 作用，在转录后水平负向调控Bcl-2的表达［3］。

然而在滤泡性B 细胞淋巴瘤(FL)和弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBCL)，BCL2 基因的易位(如滤泡性淋巴瘤的标志t (14;18))将BCL2 基因置于IgH 基因启动子下游，理论上会产生BCL2蛋白的高表达［6］。在DLBCL，20 -30%病例出现BCL2 基因易位，BCL2 基因易位与BCL2 蛋白的表达是否相关，多种报道不一致［7，8］。而miR -15a 和miR-16 -1 是否影响DLBCL 中BCL2 蛋白的表达，未有相关研究报道。本研究通过荧光定量PCR 检测30≥弥漫性大B 细胞淋巴瘤中miR-15a 和miR-16 -1的表达量，免疫组化检测BCL-2 和Ki-67 蛋白的表达，发现miR -15a、miR-16 -1 表达水平与BCL-2 蛋白表达、高增殖指数(Ki-67≥50%)呈负相关，因而推测BCL-2可能是miR -15a 和miR -16 -1 发挥作用的靶基因。bcl-2 基因是一种细胞凋亡相关基因，其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥着重要的作用。miR-15a 和miR-16 -1 是一种肿瘤抑制基因，其表达水平的下调可能对bcl -2 基因的靶向抑制作用减少，BCL-2 基因表达增加，参与DLBCL 形成的凋亡抑制途径。但miR -15a 和miR -16 -1 在DLBCL 是否还参与其他信号通路的调节以及具体机制，还需进一步研究。

［1］张继新，吕晓涛，高颖，等. microRNA -21 在弥漫大B 细胞淋巴瘤中的表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志，2010，26 (2) : 163.

［2］马文静. 食管鳞癌中microRNA-21的作用及其对磷酸酶张力蛋白的影响［D］. 乌鲁木齐:新疆医科大学，2010. 64.

［3］Cimmino A，Calin GA，Fabbri M，et al. miR -15 and miR -16 induce apoptosis by targeting BCL2 ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102 (39):13944.

［4］朱丹霞，缪扣荣，朱远东，等. 实时定量PCR 检测白血病相关miRNA 方法的建立［J］. 中国实验血液学杂志，2010，18 (3):757.

［5］Eis PS，Tam W，Sun L，et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102 (10):3627.

［6］Roehle A，Hoeleg KP，Repsilber D，et al. MicroRNA signatures characterize diffuse large B -cell lymphomas and follicular lymphomas ［J］. British Journal of Haematology，2008，142 (5):732.

［7］Huang JZ，Sanger WG，Greiner TC，et al. The Bcl -2/IgH define a unique subset of diffuse large B-cell lymphoma with a germinal center B-cell gene expression profile ［J］. Blood，2002，99 (7):2285.

［8］Barrans SL，Evan PA，Connor SJ，et al. The Bcl -2/IgH is associated with germinal center -derived diffuse large B - cell lymphoma and is a strong predictor of outcome ［J］. Clin Cancer Res，2003，9 (6):2133.