转基因抗虫棉抗性纯度对产量的影响

孙国清， 张 锐， 王 远， 任茂智， 孟志刚， 周 焘， 陈全家， 曲延英， 郭三堆*

1.中国农业科学院生物技术研究所，国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京100081；

2.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐830052

转基因抗虫棉抗性纯度对产量的影响

孙国清1，2， 张 锐1， 王 远1， 任茂智1， 孟志刚1， 周 焘1， 陈全家2， 曲延英2， 郭三堆1*

1.中国农业科学院生物技术研究所，国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京100081；

2.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐830052

外源杀虫基因能否在转基因棉花中高效、稳定表达是影响转基因棉花应用前景的关键。本文从转基因棉花杀虫蛋白表达水平出发，通过在转基因棉花品种的种子中混杂非转基因棉花品种的种子，研究不同品种纯度的转基因棉花杀虫蛋白表达水平对转基因抗虫棉的抗虫性影响。本研究选用2个转基因抗虫棉品种GK12和SGK321，设置了8种混杂比例，通过分子检测和室内生测试验表明，随着抗虫纯度的下降，棉铃虫危害等级升高，幼虫校正死亡率下降，品种抗虫能力下降；从田间实验结果来看，随着抗虫纯度的下降，铃数减少，空果枝数增多，最终致使产量大幅下降，从而出现所谓的“抗虫棉不抗虫”现象。结果显示，转基因抗虫棉品种抗性纯度至少要达到97%，才可以保证产量不至于损失太大。

抗虫性；产量；种子纯度；转基因棉花

我国转基因抗虫棉推广历时十七年，为我国的农业发展做出了巨大贡献［1］。但是，随着品种的推广应用，生产上应用品种的混杂问题也越来越突出。品种混杂会造成品种的种性降低，质量下降。由于目前市场上，很多品种（系）性状还未稳定，利用杂种F2代进行种植，某些位点可能还处于分离期，或是由于天然异交原因使一些品种在推广过程中产生混杂，致使品种内可能不同程度混有非转基因棉花种子，对其抗虫性和产量产生影响。

棉花属于锦葵科棉属，为常异花授粉作物，天然异交率达3%～20%，高的可达60%，以自花授粉为主，主要性状上多处于同质结合状态，但由于天然异交率较高，遗传基础比较复杂，群体则多处于异质结合状态［2］。生产上使用的品种多为群体品种或杂交种。因此，棉花种子在使用过程中，容易由于天然异交的原因，从而导致品种纯度降低。同时，棉花种子生产环节多，也容易产生各种形式的机械混杂。另外，我国多数棉花生态区内广泛存在同一时期多种品种共存的现象，这样就很可能造成品种间杂交，从而导致纯度下降及品种退化现象。品种退化现象的突出表现是群体中异型株的增多［3］。随着品种纯度的下降，产量和经济性状亦相应下降。然而，品种混杂是否会对转基因抗虫棉的抗虫性产生影响及其影响程度，这一问题前人尚未进行深入研究。本研究选用两个转基因抗虫棉品种GK12［4～6］和SGK321［7］都是具有自主知识产权，且在国内应用较广的转基因抗虫棉品种中，设置8种混杂比例，对品种混杂是否会对转基因抗虫棉的抗虫性产生影响进行了系统分析。

1 材料与方法

1.1 实验品种和试剂

选取本实验室保存的转Cry1Ab／Ac基因单价抗虫棉花品种GK12及其受体泗棉3号；转Cry1Ab／Ac、CpTI基因双价抗虫棉花品种SGK321及其受体石远321。

Envirologix蛋白检测试剂盒购自美国一龙公司；尿素、NaOH、无水乙醇等其他试剂均使用国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

分别于2008年、2009年在北京平谷试验基地、河北廊坊试验基地种植2个转基因棉花品种，在转基因品种中混杂非转基因品种种子（其受体品种），共设置8种混杂比例，即100%、99%、97%，95%、90%、80%、50%和0%，每个比例设三个重复，种植田间管理同大田。待出苗长至3片真叶时，进行卡那霉素涂抹鉴定，卡那霉素鉴定浓度为1 mg／mL，按照预定混杂比例拨除多余植株。

1.3 抗性纯度检测

采用金标试纸条（重庆金标公司）方法检测抗虫基因的表达产物。随机抽取样品种子30粒进行检测，三次重复。

1.4 外源基因的分子鉴定

采用改良CTAB方法［8，9］提取棉花基因组，对外源基因在棉花基因组中的拷贝数进行鉴定。采用通用引物进行PCR反应，引物序列为：通用1：5′-CCTCTTCTAACTTGCCCTCCGC-3′；通用2：5′-CACCCACGATGTTACCGAGTG-3′。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应所需酶及反应底物等均购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR反应扩增程序为：95℃5min；94℃1min，55℃1 min，72℃1.5 min，30个循环；72℃10 min。

1.5 杀虫蛋白的测定

使用Envirologix试剂盒定量蛋白质表达量。在苗期、蕾期、花期、铃期4个棉花生育期间，随机采集从顶端数第一片完全初展开顶叶、蕾期的顶叶和小蕾（直径约0.5～0.7 cm）、花期的顶叶、小蕾和花器官、铃期的顶叶、小蕾、花器官和小铃（直径约1.2 cm）置于密封袋中，用液氮速冻后置于冰盒内，迅速带回实验室内进行棉花抗虫基因表达蛋白的检测。在棉花生长的每个生育期，每个棉花品种随机采样量为10片（个），每10片（个）样品混样称取0.1 g，各取三次，液氮冷冻后，按照Envirologix试剂盒提供的方法提取蛋白质，在450 nm处测定其吸光值，根据标准曲线得出检测数据。

1.6 室内接虫鉴定

室内接虫鉴定检测技术参照农业部953号公告检测标准［10］进行。

1.7 数据分析

数据采用SPSS17.0软件处理分析。

2 结果与分析

2.1 品种纯度和真实性鉴定

为了确保样品的纯度和转基因品种的真实性，首先对样品基因组进行Bt基因的分子鉴定。随机抽取10份样品，提取基因组进行检测。Bt基因的PCR检测结果见图1，在1～10泳道都扩增出和阳性对照相同的大约600bp的条带，证明样品中含有Bt杀虫基因；Southern杂交实验分析转基因品种中Bt基因在植物体内的整合情况，结果见图2，GK12中含有Bt基因，为7个拷贝；SGK321中也含有Bt基因，为2个拷贝。

图1 转基因抗虫棉的PCR检测的部分结果Fig.1 PCR of transgenic insect-resistant cotton.

图2 转基因抗虫棉的Southern杂交结果Fig.2 Southern blot of transgenic insect-resistant cotton.

2.2 杀虫蛋白的时空表达

在确保获得纯度相对较高的样品材料后，采用Envirologix试剂盒检测Bt基因在GK12和SGK321中的时空表达水平，结果见图3。从图中可以看出，两个品种的抗虫蛋白表达均具有时空特异性。从时间上来看，两个品种杀虫蛋白的表达量基本呈现出前期表达量高，后期表达量低的趋势，但叶和蕾在8月11日时有一个较高的峰值，随后又表现出下降的趋势。从空间上来看，两个品种叶片中杀虫蛋白的表达量最高，其次为蕾和花，铃中杀虫蛋白的表达量相对较低。比较BT

杀虫蛋白在GK12和SGK321的表达量，发现无论是在叶、蕾、花，还是铃中，SGK321中Bt杀虫蛋白的表达量都高于GK12中Bt杀虫蛋白的表达量。

图3 GK12和SGK321中BT杀虫蛋白的时空表达Fig.3 The spatial and temporal expression of BT insecticidal protein in GK12 and SGK321.

2.3 混杂比例与抗虫性间的关系

混杂不同比例非转基因种子的GK12和SGK321两个品种的植株叶片危害等级与校正死亡率间表1。结果表明，随着GK12和SGK321的种子纯度逐渐降低——即混杂的非转基因种子比例的升高，棉铃虫的危害等级逐渐升高，棉铃虫的死亡率逐渐降低。其中，GK12的危害等级由0.2上升到4.6，危害等级与种子纯度间的相关系数为0.93，达到极显著相关（P＜0.01）；棉铃虫校正死亡率也从97.67%下降到0，棉铃虫校正死亡率与种子纯度间的相关系数为0.96，达到极显著相关（P＜0.01）。SGK321的危害等级由0.3上升到4.8，危害等级与种子纯度间的相关系数为0.94，达到极显著相关（P＜0.01）；棉铃虫校正死亡率也从97.5%下降到0，棉铃虫校正死亡率与种子纯度间的相关系数为0.99，达到极显著水平（P＜0.01）。棉铃虫食喂转基因抗虫棉叶片时，双价抗虫棉SGK321比单价抗虫棉GK12校正死亡率要高。由此可见，纯度的下降对棉花的抗虫性存在极显著影响。

表1 GK12和SGK321不同混杂比例对叶片危害等级及校正死亡率的影响Table 1 The effect of seedsmixed proportion on bollworm damage level and corrected mortality of H.armigera larvae in GK12 and SGK321.

2.4 混杂比例与产量间的关系

转基因品种的不同混杂比例对棉花产量有影响。结果表明，无论是GK12还是SGK321，产量均与种子纯度呈显著正相关关系（图4，表2）。其中，GK12的产量与种子纯度间达到极显著相关水平；SGK321的产量与种子纯度间达到显著相关水平。随着转基因品种种子纯度的降低，混杂的非转基因种子的比例升高，该品种的产量显著降低。

解析产量降低的因素，发现主要是由于品种的混杂致使整个群体的株高下降，子叶始节升高，始果枝节位下降，果枝数减少，空果枝数增多，铃数减少，单铃重降低，品质变劣，以至于最终产量大幅降低。混杂对于品种群体的特征特性影响随着混杂程度的加深而越来越大，整个群体更易遭受棉铃虫的危害，导致棉结铃率降低，空果枝数增高，单铃重减小，最终产量大幅下降。从混杂比例来看，GK12中纯度达97%时，与100%GK12在产量上的差异即达到显著水平；SGK321中纯度达95%时，与100%sGK321在产量中差异达到显著水平，也就是说，转基因抗虫棉品种抗性纯度至少要达到97%，才可以保证产量不至于损失太大。

图4 GK12和SGK321不同混杂比例对产量的影响Fig.4 The effect of seedsmixed proportion on cotton yields of GK12 and SGK321.

表2 GK12和SGK321不同混杂比例对产量影响的差异显著性分析Table 2 Significance analysis of the effect f o seedsmixed proportion on cotton yields of GK12 and SGK321.

3 讨论

品种的混杂严重影响着品种的农艺性状、品质性状和产量，直接影响了品种的生命力，加速了品种的退化。而造成品种混杂的原因很多，如机械混杂、人为混杂，自然混杂等，因此，应当尽量避免品种混杂现象的发生。本文首次利用室内生测，杀虫蛋白检测技术和农艺性状等方法相结合综合分析了品种抗性纯度对转基因棉花产量的影响，科学的论断出转Bt基因棉花品种抗性的下降对于产量的影响是非常显著的，单价抗虫棉要比双价抗虫棉品种抗性纯度要更为严格些，在今后的育种过程中，有意识的利用双价抗虫棉品种作为亲本是很有必要的，不仅延缓了棉铃虫对Bt杀虫蛋白的抗性，而且提高了产量。在品种推广过程中，尽量保证品种的纯度至少要达到97%以上，在虫害发生时期才可能保证产量不受较大的损失。

［1］ 张锐，王远，孟志刚，等.国产转基因抗虫棉研究回顾与展望［J］.中国农业科技导报，2007，9（4）：32-42.

［2］ 石跃进，袁钧，潘转霞，等.棉花的自花授粉与天然异交［J］.中国棉花，2001，28（1）：7-8.

［3］ 王瑛，张新建.浅谈棉花品种退化的原因及对策［J］.种子世界，2005，8：32-33.

［4］ 郭三堆，崔洪志.中国抗虫棉GFM Cry1A杀虫基因的合成及表达载体的构建［J］.中国农业科技导报，2000，2（2）：21 -26.

［5］ 杨玉强，刘军，杨瑞宪，等.转基因抗虫棉GK12的进一步纯合和选育［J］.农业科技通讯，2006，7：36.

［6］ 眭书祥，赵国忠，李爱国，等.转基因抗虫棉种质资源GK12性状与利用情况分析［J］.河北农业科学，2011，15（5）：61-64.

［7］ 眭书祥，赵国忠，李爱国，等.转Bt＋CpTI基因抗虫棉种质资源SGK321性状与利用分析［J］.科技导报，2008，26（9）：42-45.

［8］ 宋国立，崔荣霞，王坤波，等.改良CTAB法快速提取棉花DNA［J］.棉花学报，1998，10（5）：273-275.

［9］ Huang J，Ge X，Sun M.Modified CTAB protocol using a silicamatrix for isolation ofplantgenomic DNA［J］.Biotechnique，2000，28（3）：432-434.

［10］ 中华人民共和国国家标准.转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第1部分：对靶标害虫的抗虫性［S］.农业部953号公告-12.1-2007，2007-12-18.

Influence of Seed Purity on Insect Resistance and Yield in Transgenic Cotton

SUN Guo-qing1，2，ZHANG Rui1，WANG Yuan1，REN Mao-zhi1，MENG Zhi-gang1，ZHOU Tao1，CHEN Quan-jia2，QU Yan-ying2，GUO San-dui1*
1.Biotechnology Research Institute，National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；
2.College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China

The efficient and stable expression of exogenous insecticidal genes in transgenic cotton is the key of transgenic cotton application.In order to compare the insect-resistant effect of transgenic cotton under different seeds purity，two transgenic varieties GK12 and SGK321 were mixed with non-genetically modified cotton seeds in eight different proportion for evaluating insecticidal protein expression level，themolecular detection and indoor hygiene tests showed thatwith the decline in the purity of insect resistance，cotton bollworm damage level gradually increased，corrected mortality of H.armigera larvae decreased，varieties of insect-resistant capacity declined.The field experiments indicated thatwith the decline of the insect resistant purity，boll number reduced，the number of empty fruit branches increased，which ultimately led to a sharp decline in production，and thus gave rise to the so-called“Bt cotton is not insect resistant”.In conclusion，the decline of seed purity had significant effection on insect resistance and cotton yield.In order to ensure high yield，the purity of transgenic insect-resistant cotton should be higher than 97%.

insect resistance；yield；seed purity；transgenic cotton

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.06

2012-12-05；接受日期：2012-12-25

国家转基因生物新品种培育重大专项“转基因耐旱耐盐碱棉花新品种培育”（2011ZX08005-004）资助。

孙国清，助理研究员，博士，研究方向为植物基因工程。*通讯作者：郭三堆，研究员，从事棉花基因工程研究。E-mail：guosandui＠caas.cn