猪链球菌II型高免卵黄抗体粉的研制

李 斌李会荣刘学江杨智国常维山

（①山东农业大学动物科技学院 271018 ②山东省饲料质量检验所）

试验研究

猪链球菌II型高免卵黄抗体粉的研制

李 斌①②李会荣②刘学江②杨智国②常维山①*

（①山东农业大学动物科技学院 271018 ②山东省饲料质量检验所）

试验用猪链球菌II型CVCC606株制备疫苗免疫产蛋鸡，首免后7d检测到低水平的卵黄抗体，再经3次强化免疫，于末次免疫后7d卵黄抗体效价达到9log2，最高效价达到10log2，高水平卵黄抗体可维持到末次免疫后50d，随后出现下降。收集抗体效价大于9log2的高免蛋卵黄，经喷雾干燥成卵黄抗体粉，效价在10log2以上，卵黄抗体粉质量稳定，于室温(25℃)保存6个月抗体水平无明显降低。体外抑菌试验表明，高免卵黄抗体粉可有效抑制猪链球菌II型CVCC606株和猪链球菌II型强毒分离株。高免卵黄抗体粉可有效预防猪链球菌II型菌株对BALB/c小鼠的致死性感染。

链球菌 卵黄抗体 免疫

猪链球菌是致猪链球菌病的主要病原，可引起猪脑膜炎、败血症及关节炎等疫病，人通过特定的传播途径亦可感染。目前猪链球菌已鉴定出35个血清型(1至34型及1/2型)，其中血清II型是引起人、猪感染的主要致病菌，在我国，1998年江苏猪群发生了猪链球菌病，随后发生人感染死亡报道，分离菌为猪链球菌II型；2005年四川省暴发人、猪感染猪链球菌II型疫情。近年来，猪链球菌II型感染在我国猪群的发病率日渐增高，其可单独治病，也常常和其他病原混合感染，致发病猪高热或死亡，造成了很大损失。

对于猪链球菌II型感染的预防，目前国内主要采用灭活疫苗，但其使用效果存在差异，且抗体保护时间短，需多次免疫才能获得较强的免疫力。主要用敏感的抗生素治疗，但随着抗生素的大量应用，耐药性日趋严重，治疗效果不佳。卵黄抗体在预防和治疗动物疾病方面具有特异性强、作用迅速、无残留等优点，得到了广泛应用。笔者尝试进行猪链球菌II型高免卵黄抗体粉的研制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 BALB/c小鼠，15～20g，购自山东大学实验动物中心；160日龄罗曼商品代蛋鸡，山东济南某鸡场。

1.2 菌株 猪链球菌2型CVCC606株，购自中国兽医药品监察所；猪链球菌2型强毒分离株，分离自山东东营某猪场患败血症死亡猪，由山东农业大学动科院鉴定。

1.3 血清 猪链球菌2型阳性鸡血清，自制的猪链球菌II型抗原高免鸡采血分离而成；阴性鸡血清，未经猪链球菌II型抗原免疫的健康鸡血清。

1.4 培养基、试剂及喷雾干燥设备 普通琼脂平板，血琼脂平板，血清肉汤(含5%牛血清、0.5%葡萄糖)，10号白油，硬脂酸铝，吐温-80、司盘-80，甲醛，醋酸，醋酸钠。LPG-25型喷雾干燥机，购自常州市东南干燥设备有限公司。

1.5 凝集试验用抗原的制备 猪链球菌2型CVCC606株接种血琼脂平板培养过夜，同样方法复壮传代3次，挑取生长旺盛的典型菌落3～4个接种于血清肉汤培养基，静置培养17～24h；加甲醛至终浓度为0.3%，37℃灭活24h，其间震荡摇匀5～6次；6000rpm离心分离沉淀菌体，用PBS (0.01mol，pH7.20悬浮沉淀菌体，再离心洗涤2次，用PBS悬浮至菌浓度为2×109的菌液。作为凝集试验用抗原。

1.6 免疫抗原的制备 同前凝集试验用抗原的制备方法，用PBS(0.01mol，pH7.2)悬浮至菌浓度为1×109的菌液，作为免疫抗原制备用抗原液。按照王明俊[1]介绍的方法，将94%的10号白油和6%的司盘-80混合后，加硬脂酸铝加热溶解，121℃灭菌为油相。抗原液加入灭菌的吐温-80为水相。按油相水相2∶1比例，少量油相搅拌的同时，缓慢加入水相和剩余的油相，并高速搅拌至形成稳定的油包水型疫苗，即为免疫用抗原。进行无菌检验，合格后4℃冷藏备用。

1.7 蛋鸡的免疫 160日龄罗曼商品代蛋鸡300只，用免疫抗原进行免疫，首免剂量为1ml，然后每隔14d进行强化免疫，共强化免疫3次，剂量分别为1.5、2、2.5ml，采用颈部皮下、胸部或腿部肌肉多点注射的方式，每点注射剂量不超过0.6ml。同时设不免疫对照鸡30只。

1.8 免疫鸡蛋抗体水平检测 于首次免疫后每隔7d，随机取免疫组鸡蛋20枚，进行抗体水平检测。卵黄抗体分离提取处理方式如下：分离卵黄，混合、搅拌均匀为卵黄液；配制0.02mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.5)；量取蛋黄液和醋酸盐缓冲液，按蛋黄液缓冲液1∶3的比例混合，充分摇匀；加入3%的辛酸，摇匀后静置过夜；分取上清液，用滤纸过滤，收集滤液，进行卵黄抗体效价测定。同时取未免疫对照组鸡蛋同法处理，进行抗体效价测定。

采用平板凝集试验改良进行抗体效价测定[2]。在玻板的网格中每格中央加入灭菌PBS 50μl，然后吸取经处理的卵黄抗体样品50μl加入第一格中，用移液器头充分混匀后，吸取混合液50μl加于第二格中，充分混匀，依次进行倍比稀释至第8格(即稀释1024倍)，吸出50μl弃去。第9、10格和第11格分别作为抗原对照和阳性、阴性血清对照。然后向每格的液滴上加入检测用抗原50μl，用牙签搅匀。2～5min后观察玻板每格的凝集反应现象，阴性血清对照格轻度均匀浑浊(抗原被2倍稀释的状态)，判定为阴性，标为“－”，阳性对照格出现絮状块，判定为阳性，标为“＋”。出现的凝块越多，液体越透明，则表明阳性反应越强，由弱到强分别标为“+”“++”“+++”“#”。出项“++”以上凝集现象的血清最高稀释度为该份血清的效价(卵黄抗体在提取过程中已经进行了2log2的稀释）。

1.9 高免卵黄抗体粉的制备及效价测定 当所测蛋黄中抗体水平达9log2以上时收取鸡蛋。用新洁尔灭对鸡蛋进行表面消毒，打破鸡蛋，蛋液经搅拌后加人2倍体积的生理盐水搅拌混匀，用喷雾干燥机进行喷雾干燥，进风温度140℃、出风温度控制在72℃，喷雾干燥成粉。推算单位体积卵黄液生产卵黄抗体粉的质量，在加工后，按比例取一定量的卵黄抗体粉溶于注射用水中，处理后进行抗体效价测定。

1.10 卵黄抗体粉质量分析及存放稳定性试验 取3批次卵黄抗体粉样品进行所含水分测定。卵黄抗体粉密封分装于铝箔袋中，在25℃恒温箱中放置，每隔1个月取样，样品按1.9所述方法进行抗体效价测定，考察抗体粉的稳定性。

1.11 卵黄抗体粉体外抑菌试验 猪链球菌2型CVCC606株和强毒分离株分别于血清肉汤中培养至菌浓度达到1×105CFU/ml，每株菌培养物分装3个无菌试管中，每试管5ml；卵黄抗体粉加入适量水搅匀，提取，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，无菌操作取部分滤液用灭菌生理盐水进行1∶2、1∶4两个稀释度稀释备用。于每株菌的三个试管中分别加入不同稀释度卵黄抗体粉提取过滤溶液1ml。37℃继续培养，分别于1、2、3h取样0.1ml，涂布于血琼脂平板上进行菌落计数。

1.12 卵黄抗体粉对小鼠的被动保护试验 （1）猪链球菌II型CVCC606株和猪链球菌2型强毒分离株对小鼠的LD50的测定。将55只BALB/c小鼠随机分成11组，每组5只，第11组作为对照组，腹腔注射无菌生理盐水0.2ml，将两株链球菌血清肉汤培养物分别用无菌生理盐水稀释至菌浓度为3×108、3×107、3×106、3×105、3×104cfu/ml五个稀释度，每组小鼠腹腔注射不同稀释度的菌液0.2ml，接种后观察并记录每组小鼠的发病、死亡情况，试验时间为7d，按Reed-Muench法计算2个菌株的LD50。（2）卵黄抗体粉对小鼠的被动保护试验。40只BALB/c小鼠随机分成4组，每组10只，1、3组每天取用7倍生理盐水稀释并混匀的卵黄抗体粉溶液0.2ml滴口1次，连用3d，第2、4组用0.2ml生理盐水滴口作为对照组，第4天1、2组和3、4组分别用5LD50的猪链球菌II型CVCC606株和强毒分离株腹腔注射攻毒，判断卵黄抗体粉对小鼠的保护率。

2 结果与分析

试验制备的免疫抗原为油包水型矿物油佐剂疫苗，为乳白色；检验无杂菌生长。

2.1 蛋鸡免疫后抗体水平监测 免疫鸡的卵黄中抗体变化如下图，首次免疫后7d开始检测到特异性抗体，抗体效价于第4次免疫后7d达到9log2，末次免疫后50d抗体水平仍然维持在9log2以上，抗体水平在第56天降至8log2以下。

图 蛋鸡免疫后抗体水平变化情况

2.2 喷雾干燥对卵黄抗体效价的影响 喷雾干燥后的卵黄抗体粉略有蛋香味，色泽略显黄色，质地均匀，粒度大约在40目左右。不同批次卵黄抗体在喷雾干燥前后的抗体效价见表1(喷雾干燥后得到的卵黄抗体粉重量约为干燥前卵黄液的46%，因此，按此比例加入注射用水稀释后同卵黄液的方法进行抗体水平测定)。

表1 喷雾干燥前后卵黄抗体效价变化情况 (log2)

2.3 卵黄抗体粉水分含量 3批次卵黄抗体水分含量分别为3.4%、3.8%、3.3%，有利于产品的保存。

2.4 卵黄抗体粉贮藏稳定性试验 卵黄抗体粉密封保存于铝箔袋中，放置25℃恒温箱中，每月取样测定效价。结果见表2。

表2 卵黄抗体粉抗体效价变化情况 (log2)

2.5 卵黄抗体粉的体外抑菌试验 2株菌培养至菌浓度为1×105所用时间约为4h。当高免卵黄抗体粉提取液效价达到7log2时，对猪链球菌2型CVCC606株和强毒分离株均有抑杀作用；稀释1倍后(1∶2稀释)，仍能抑杀CVCC606株，但不能完全抑杀强毒分离株；1∶4稀释，对两株细菌的抑杀效果均很差。同批未经免疫的对照组鸡卵黄抗体粉液则无抑菌活性。抑菌试验结果见表3。

表3 不同培养时间(h)培养液中菌含量 (cfu/ml)

2.6 卵黄抗体粉对小鼠的保护试验 （1）不同菌株对BALB/c小鼠LD50的测定。两株菌高剂量组(3×108CFU/ml)小鼠于攻毒后约6h开始出现死亡，2d内全部死亡，而低剂量组(3×104CFU/ml)部分小鼠则出现一过性症状后，在7d观察期内，全部存活。试验计算得猪链球菌II型CVCC 606株和强毒分离株对BALB/c小鼠的LD50分别为3.1×107CFU和1.1×107CFU，因此，卵黄抗体粉保护试验用的攻毒菌量(5倍LD50)分别为1.05×108CFU(猪链球菌II型CVCC 606株)和5.5×107CFU(猪链球菌II型强毒分离株)。（2）卵黄抗体粉对小鼠的被动保护试验。卵黄抗体粉对小鼠的被动保护试验结果见表4。服用对照组鸡卵黄抗体的小鼠于攻毒后均表现出明显的临床症状：挤堆、反应迟钝、呼吸紧促等，第1组于攻毒后4h开始出现死亡，1d内全部死亡，第3组则在9h内全部死亡。服用免疫组卵黄抗体粉的第4组小鼠于攻毒后第2天死亡2只，其余全部存活，保护率为90%，而第2组小鼠全部存活，保护率为100%。

表4 卵黄抗体粉对BALB/c小鼠的被动保护试验结果

3 讨论

（1）用猪链球菌2型CVCC606株制成油乳剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首免后7d可以检测到蛋黄中特异性的卵黄抗体，强化免疫3次后，蛋黄中抗体水平于末次免疫后7d达到9log2，高水平卵黄抗体维持约50d，此后开始慢慢下降，故将再次免疫的周期定位50d。（2）卵黄抗体具有较高的稳定性，对酸、碱和热均有一定的抵抗力。卵黄抗体在鸡蛋中可以较长时间保持活性，但在较高温度时，鸡蛋容易变质，致使卵黄抗体也不能长时间贮存。考虑到高温对抗体活性的影响，选择了较温和的喷雾干燥的工艺，在较低的进风(140℃)、出风温度(72℃)条件下，抗体效价在喷雾干燥前后基本没有变化，有效的保证了抗体的活性。贮存试验表明，在常温条件下，抗体可以保存6个月以上。（3）体外抑菌试验表明，制备的猪链球菌血清II型卵黄抗体粉对猪链球菌血清II型菌株具有良好的抑杀作用，卵黄抗体对对应的制备免疫用抗原的菌株的抑杀效果更为明显，于较低浓度就可以完全杀灭细菌，对强毒分离株，也表现出较强的杀灭作用，但稍差于前者。BALB/c小鼠被动保护试验也表明卵黄抗体粉对不同菌株感染的保护存在差异。因此，用自家苗做抗原制备卵黄抗体粉来预防本场猪链球菌II型感染效果更好。（4）研究表明，新生仔猪肠道可吸收异种蛋白[3]。近年来国内外学者开展了很多利用卵黄抗体防治猪传染病的研究。Yokoyama等[4]将提纯的ETEC的K88、K99、987P制成单价菌毛蛋白苗，免疫蛋鸡获得卵黄抗体粉末，EIISA检测结果表明，抗K88、K99、987P的卵黄抗体能够特异性地与相应的菌毛抗原作用。用卵黄抗体对不同ETEC菌株攻毒的新生仔猪进行口服治疗，治疗组仔猪全部存活，而对照组仔猪死亡率超过80%。高云英等[5]用ETEC的K88、K99、987P标准菌株和地方分离菌株制成多价菌体卵黄抗体经预防、攻毒试验及临床治疗效果观察，对新生仔猪免疫保护率可达90%以上，3日龄仔猪攻毒保护率达98%以上，3～11日龄仔猪临床治愈率达95%以上。李学伍等[6]的试验结果表明，应用多种血清型大肠杆菌制备多价大肠杆菌疫苗免疫蛋鸡，从而制备出的卵黄抗体对腹泻仔猪的治愈率蛋鸡，从而制备出的卵黄抗体对腹泻仔猪的治愈率最高可达97.7%。本研究为口服卵黄抗体预防猪链球菌病奠定了基础。

[1] 王明俊. 兽医生物制品学[M]. 北京∶ 中国农业出版社. 1997.

[2] 陈国强, 张敬友, 张常印等. GBT 19915.2-2005猪链球菌II型平板和试管凝集试验操作规程[S]. 北京∶ 中国标准出版社. 2005.

[3] 单虎, 陈伟华, 王述柏等. 初乳对新生仔猪血液蛋白的电泳形态影响的研究[J]. 畜牧兽医学报, 1997, 28(6)∶ 504-510.

[4] Yokoyama H, Peralta RC, Diaz R,et al.Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets. Infect Immun.1992,60(3)∶998-1007.

[5] 高云英, 赵发苗, 张金良等. 鸡抗猪大肠杆菌高免卵黄抗体的研制与应用[J]. 畜牧兽医杂志, 2003, 22(1)∶ 6-8.

[6] 李学伍, 张改平, 阎玉河等. 仔猪大肠杆菌病多价卵黄抗体粉的特性及应用[J]. 中国兽医杂志. 2000, 26(10)∶ 57-58.

S852.4+3

A

1007-1733(2013)06-0001-04

2013–04–15）

*通讯作者