猪附红细胞体三种染色方法的比较

吕成林 杜秋霞 （山东省嘉祥县畜牧兽医局 272400） 郑丽艳（山东省嘉祥县科技局）

猪附红细胞体三种染色方法的比较

吕成林 杜秋霞 （山东省嘉祥县畜牧兽医局 272400） 郑丽艳*（山东省嘉祥县科技局）

分别利用姬姆萨氏、瑞氏、吖啶橙3种方法对猪附红细胞体进行染色，结果表明：3种染色法大多数可见星红细胞体，吖淀橙染色可在90%以上出现星红细胞的样本中检出附红细胞体。

附红细胞体 姬姆萨氏 瑞氏 吖啶橙 染色

附红细胞体病是由附红细胞体寄生于红细胞表面、血浆、骨髓等部位引起的一种人畜共患病。该病在临床上以高热、贫血、黄疸为主要特征，严重威胁着畜牧业的发展和人类健康，并呈范围扩大趋势，该病已引起人们的广泛关注。本文对猪附红细胞体的3种诊断方法进行了比较，以期为临床实践诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 猪附红细胞体待检血液

采自自然发病的附红细胞体患猪的静脉血，并用健康猪的静脉血做阴性对照。其中的阴性对照是用瑞氏、姬姆萨氏、吖啶橙染色后为阴性的健康猪的血液。

1.2 姬姆萨氏染色

1.2.1 姬姆萨氏染色液的配制 按文献(曹澎辉，1991)进行。取姬姆萨染料0.6g，加入50ml甘油内，于56℃下加热2h，然后加入甲醇50ml，于3～5d后过滤，即为原液。使用时与各种pH的PBS液以1∶20的比例混合，即为染色液。

1.2.2 染色方法 无菌采取猪静脉血，与染色液1∶1混合。推片、干燥后用甲醇固定，待甲醇挥发干净后将玻片浸于不同pH的染色缸中，每种pH值放4张，并分别于6、12、18、24h后进行观察。

1.3 瑞氏染色

1.3.1 染色液的配制 按常规配制。

1.3.2 染色方法 推片自然干燥后，滴加染色液，染色3min，然后加等量蒸馏水再染5min，蒸馏水冲洗。

1.4 吖啶橙染色

1.4.1 吖啶橙染色液的配制 按文献(任怡敏，1996)进行。将0.01g吖啶橙溶于100ml Tris-HCl(0.05mol/l，pH7.5)缓冲液中。

1.4.2 染色方法 将涂有标本的玻片用甲醇固定，待甲醇挥发干净后将玻片置湿盒内，加适量吖啶橙染液，37℃，100min。用pH7.4的PBS轻轻冲洗两次，在荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 姬姆萨染色

2.1.1 不同pH值染色液对染色效果的影响 在pH 8.0以上的碱性环境中，姬姆萨染料对附红细胞体的着色效果较好，附红细胞体着色较深，比较清晰，而在pH8.0以下的环境中则着色不好。见表1。

表1 不同pH值染色液染色效果

2.1.2 染色时间的影响 染色6或12h观察，整个血片着色不好，18h以上可获得满意效果，镜下观察附红体着色深，轮廓分明。姬姆萨氏染色后在红细胞表面上可见到0.5-1.5μm的蓝紫颗粒，呈圆形、逗号状，每个红细胞上可出现多个。

2.2 瑞氏染色

瑞氏染色后细胞较大，红细胞和附红细胞体均为深蓝紫色，附红细胞体着色较深。在星形红细胞的突出部位或红细胞表面，可见到圆形深染的颗粒状物，每个红细胞上有3-8个不等。

2.3 吖啶橙染色

在荧光显微镜下红细胞为暗淡的绿色，附红细胞体为发明亮荧光的绿色小体。

在大多数红细胞边缘及表面上可看到一些明亮的小体，直径1μm 左右，为被吖啶橙染色的附红细胞体。

2.4 不同染色方法比较

临诊出现发烧、贫血、皮红、紫绀等症状的病猪血液推片，大多数可见星形红细胞，吖啶橙染色可在90%以上的出现星形红细胞的样本中检出附红细胞体。见表2。

表2 不同染色方法比较

3 讨论

目前，临床兽医往往根据临床症状、病理变化或显微镜下有无变形的红细胞作为附红细胞体的诊断依据，有些学者由于不能直接看到附红细胞体的存在，不承认附红细胞体的致病作用(王水周, 2004; 张家静, 2003)。本研究结果表明，使用正确的染色方法，可在大多数自然发病的病例中看到附红细胞体，在严重病例中，绝大多数红细胞上都可以看到附红细胞体，而且数量越多，看到红细胞体越多，细胞变形越明显。三种染色方法都可以使附红细胞体着色，但是各有优缺点。

姬姆萨氏染色的优点是着色效果较好，缺点是染色所需时间较长。另外需要注意pH的影响，pH值偏碱有利于附红体的着色。附红细胞体的颜色与染液的pH值有密切关系，pH值愈高则染色愈深。这是因为姬姆萨氏染液由天青及伊红组成，天青游离时带正电荷，伊红游离时带负电荷，被染物的主要成分为蛋白质，蛋白质本身带两种电荷，当在碱性液体中时增加，天青离子附着得多些，附红细胞体则较蓝。在稀释姬姆萨氏原液时如果使用蒸馏水(通常偏酸)，不利于区别红细胞和附红细胞体，这可能是其他作者看不到附红细胞体一个原因。染色时间对附红细胞体的着色也很重要，浸染18h以上才能获得满意的效果。

瑞氏染色的优点是简单快速，但是瑞氏染液中常常出现一些颗粒影响观察。配制染料时要研磨仔细，先倒入少量染料、少量甲醇及甲醇后继续研磨，如此反复数次。配制好后要多次过滤，使用时尽量使用中间层，以防颗粒沉积于血涂片上，影响观察效果。染色后如果标本片上附有较多颗粒，可滴加少量染液，稍后冲洗即可除去。

附红细胞体在急性阶段，吖啶橙染色后荧光显微镜下呈浅至深橘黄色。在慢性病例中呈淡黄色至淡绿色的点状。本研究中吖啶橙染片后附红细胞体呈亮绿色。另外，用吖啶橙染色时核仁和核碎片也可发出荧光，因此，血涂片应在采样的当天制作，防止出现假阳性。

很多作者认为附红细胞体不是引起病畜死亡的主要原因，主要原因是红细胞破损引起机体免疫功能下降，从而引起继发症导致机体死亡。但本研究表明红细胞上有如此多的附红体，机体必然要对其产生免疫反应，最后导致红细胞严重变形、大量裂解，而导致黄疸、溶血性贫血、死亡。

[1] 曹澎辉. 兽医微生物学及免疫学技术[M]. 北京∶ 农业大学出版社, 1991.

[2] 任怡敏, 白岚, 梁玉等. 应用吖啶橙染色快速检测沙眼衣原体[J].中华医学检验杂志, 1996, 19(2)∶ 124.

[3] 王水周, 睢春霞. 对近几年部分猪附红细胞体病诊断报道的一些看法[J]. 养禽业, 2004(2)∶ 30.

[4] 张家静, 刘小燕, 李召展等. 对猪发生附红细胞体病的调查研究和讨论[J]. 河南畜牧兽医, 2003, 24(1)∶ 26-29.

[5] Zachary J E,Besgall EJ. Erythrocyte membrance alterations associatedwith the attachment and cation of Eperythrozoon suis∶ A light and electronmicroscopic study[J]. Vet Pathol, 1995, 22∶ 164.

S852.16+4

A

1007-1733(2013)06-0004-02

2013–04–01）

*通讯作者