寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定

申 颖 李兆华 王成森 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定

申 颖 李兆华 王成森 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

对发生肿瘤的某寿光鸡群随机抽取10只鸡接种鸡胚成纤维细胞进行针对禽网状内皮组织增生病毒(REV)的分离和鉴定。分离到2株REV，对2株REV的env基因进行了扩增、克隆和序列分析，结果显示，2株REV之间的env基因核酸同源性为99.8%，与分离自中国黑龙江的HLJR0901和分离自中国台湾的Chicken/3337/05亲缘关系最近。

禽网状内皮组织增生病毒 病毒分离鉴定 序列比较

禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是禽类的一种重要的致肿瘤性疾病，其病原禽网状内皮组织增生病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)是一个禽反转录病毒群，是禽白血病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)、马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)之后第三种引起禽类发生肿瘤的病毒，不仅感染鸡，还可以感染火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和野鸡等[1]。REV主要诱发鸡急性网状细胞肿瘤、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤等。

除肿瘤外REV还可导致感染禽类胸腺、法氏囊等免疫器官发生萎缩，形成免疫抑制，降低了免疫应答，对其它病原体的敏感性增强，生产性能下降。禽通常可经垂直传播、水平传播以及经注射了被REV污染的活疫苗而感染，但很少出现肿瘤，多呈现抗体阳性。近年来，我国鸡群中REV的血清抗体阳性率逐渐增高，特别是在地方品系鸡中极为明显[2,3]，显示地方品系鸡中仍存在REV感染的巨大风险。本研究即从山东省地方品系寿光鸡中分离鉴定了2株REV并对其env基因进行了测序分析。

1 材料与方法

1.1 病料来源与背景

2013年3月，山东潍坊某鸡场饲养的商品代寿光鸡发生肿瘤病例，剖检可见肝脏和脾脏有肿瘤，随机抽取50只鸡翅静脉采血，分离血清后分别用Reticuloendotheliosis Virus Antibody Test Kit(IDEXX Laboratory，USA)按照说明书检测REV血清抗体，有17份血清样品显示REV抗体阳性。怀疑本鸡群存在REV感染。

1.2 病毒的分离鉴定

从鸡群中随机抽取10只鸡，每只鸡均无菌静脉采集抗凝血1ml，1500r/min，离心2min后取血浆接种于已长成单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)，在细胞培养皿中提前放入灭菌的盖玻片。接种后细胞在37℃孵育1h后弃掉培养液，更换为含1%胎牛血清(GIBCO，USA)的DMEM维持液，继续在37℃培养6d。盲传1代维持6d后收集培养上清液冻存于-80℃备用，培养有细胞的盖玻片以丙酮与乙醇冰(3∶2)混合液固定5min。然后以针对REV单克隆抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测[4].

1.3 分离毒株env基因的扩增、克隆和测序

1.3.1 模板DNA的提取 CEF在接种REV维持6d后收获细胞，经洗涤、离心沉淀再用抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl pH8.0，25mmol/L EDTA pH8.0，0.5%SDS)悬浮后，加入蛋白酶K(100ug/ml)消化过夜，再用苯酚抽提和乙醇沉淀后，溶解于TE(10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0)中即为样品模板DNA(50ng/μl-100ng/μl)。

1.3.2 env基因的PCR扩增 参照已发表的文献合成了一对引物用于扩增分离毒株的env基因[5]。反应体系参照文献配置，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃，60s.55℃，50s，72℃，2min；33个循环；72℃，10min。以正常CEF基因组DNA作为阴性对照。

1.3.3 扩增产物的克隆和测序 将PCR扩增产物经1.0%琼脂糖电泳鉴定并将目的条带切下以E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA，USA)回收纯化DNA，将纯化DNA连接PMD-18T Vector (TaKaRa，大连)后转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，随机挑取菌落以Plasmid Mini Kit (OMEGA，USA)提取质粒进行酶切鉴定，选取鉴定为阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司测序，序列以DNAStar软件进行分析。

1.4 不同分离株的准种比较及其分子演化

为分析所分离毒株的分子演化趋势，选取来源于鸡、鸭、鹅等不同物种的REV参考毒株的env基因进行同源性比较和进化分析，参考毒株及GenBank登录号见表1。

表1 用于env氨基酸序列比较所用REV参考株及其GenBank登录号

2 结果

2.1 REV的分离鉴定

IFA检测结果表明有2份样品显示REV阳性，与未感染的样品相比，阳性样品的胞质内均有明显的特异性绿色荧光，细胞核未被染色呈现灰暗色；而MDV和ALV均为阴性。分离到的REV命名为WFSG1301和WFSG 1302。

2.2 REV分离株env基因的克隆测序与序列分析

以WFSG1301和WFSG1302感染后细胞总DNA为模板，用PCR均扩增出了约2kb左右的清晰条带，与预期目的片段相符；阴性对照未扩增出相应的条带。对2个阳性样品的PCR产物测序结果表明，WFSG1301和WFSG1302两个毒株的env基因全长均为1761bp，编码587个氨基酸，2株REV之间env基因的核酸同源性为99.8%，氨基酸同源性为99.7%；与7株不同参考株序列比较显示WFSG1301和WFSG1302与分离自中国黑龙江的HLJR0901和分离自中国台湾的Chicken/3337/05亲缘关系最近(图1、图2)，处于进化树上同一分支。

图1 分离REV与参考毒株env氨基酸同源性

图2 以env基因WFSG1301和WFSG1302与不同REV参考毒株的进化关系

3 讨论

REV既可水平传播又可以垂直传播，但主要以垂直传播为主。垂直传播发生在输卵管内蛋形成过程中蛋清的污染，因而雏鸡孵出后已经受到了REV病毒的感染。有证据表明，早期的水平传播发生得相当迅速，发病鸡血液中循环病毒在孵化后3～6周能增加10次方倍。此外，在禽用弱毒活疫苗中污染REV引起的REV爆发案例也时有报道，如鸡痘病毒疫苗[6].

由于REV病毒的宿主范围和传播途径特点使得REV迅速传播到世界各地，严重威胁着养鸡业的发展。近年来，我国鸡群中REV的血清抗体阳性率逐渐增高，特别是在地方品系鸡中尤为严重[2,3]，并且REV与其它鸡免疫抑制性病毒的混合感染也比较普遍[7-9]。本研究即从山东省地方品系寿光鸡中分离到定了2株REV，显示地方品系鸡中REV仍然是不容忽视的问题之一。

REV基因组为正义的单链RNA，编码gag、pol和env等3种蛋白，其中env蛋白是囊膜蛋白，能被进一步裂解为表面蛋白(gp90)和穿膜蛋白(gp20)[10]，在三种蛋白中相对变异较快。对本研究分离的2株REV进行env基因序列的测定和分析显示，WFSG1301和WFSG1302与分离自鸭源的SNV株和10年前分离自中国南方的毒株HA9901株同源性较低处于2个分枝，而与分离自东北地区的毒株HLJR0901和中国台湾鸡源毒株Chicken/3337/05处于一个分枝，表明他们可能有共同的来源。

本试验分离到的2株REV的env基因同源性为99.8%但并非完全同源，显示即使在同一鸡群同时感染的REV 毒株也存在一定的差异，推测这与反转录病毒的高度异变和准种有关。病毒的准种多样性与其基因的复制关系密切，已有的研究显示H9N2 亚型禽流感病毒每个复制周期中HA 基因每个核苷酸的突变几率为2×10-3，也就是说病毒每复制一代，HA 基因上大约有一个碱基发生变异[11]。因此，在细胞培养上特别是在同一个动物体内，被称为一种病毒的群体实际上是在基因组上各有差异的准种的群体，本研究结果也进一步验证了REV准种的复杂性。

[1] Calnek BW. Disease of Poultry.11th edition. Ames∶ Iowa State University Press, 1997, 467-484．

[2] Cheng W H, Huang Y P, Wang C H. Serological and virological surveys of reticuloendotheliosis in chickens in Taiwan. J Vet Med Sci, 2006, 68(12)∶ 1315-1320．

[3] Zhao P, Ma C T, Du Y, et al. Serological survey of the Reticuloendotheliosis virus infection in China native chicken flocks. Pak Vet J, 2012, 32(4)∶ 621-623．

[4] Qin A, Lee L F, Fadly A, et al. Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup J avian leukosis virus. Avian Dis, 2001, 45(4)∶ 938-945．

[5] 邓小芸, 祁小乐, 高宏雷等. 网状内皮组织增生病病毒HLJR0901株全基因组的克隆及序列分析[J]. 中国兽医科学, 2010, 40(7)∶ 667-672.

[6] Biswas S K, Jana C, Chand K, et al. Detection of fowl poxvirus integrated with reticuloendotheliosis virus sequences from an outbreak in backyard chickens in India. Vet Ital, 2011, 47(2)∶ 147-513．

[7] Cui Z, Sun S, Zhang Z, et al. Simultaneous endemic infections with subgroup J avian leukosis virus and reticuloendothelios is virus incommercial and local breeds of chickens.Avian Pathol, 2009, 38( 6) ∶ 443-448．

[8] 金文杰, 崔治中, 刘岳龙等. 传染性法氏囊病病料中MDV、CAV、REV的共感染检测[J]. 中国兽医学报, 2001, 21(1)∶ 6-9.

[9] 姜世金, 孟姗姗, 崔治中等. 我国自然发病鸡群中MDV、REV和CAV共感染的检测[J]. 中国病毒学, 2005, 20(2)∶ 164-167.

[10] Davidson I, Yang H, Witter R L, et al. The immunodominant proteins of reticul oendotheliosis virus. Vet Microbiol, 1995, 49(3/4)∶ 273-284.

[16] 刘红旗, 黄永, 程坚等. 在疫苗免疫选择压力下H9N2亚型禽流行性感冒病毒HA基因的遗传变异[J]. 病毒学报, 2002, 18∶ 149-150.

S852.65+9

A

1007-1733(2013)10-0005-03

2013–07–08）