甘肃省特有少数民族耳聋人群中GJB2基因突变分析*

边盼盼 徐百成 马建鹂 杨小龙 李倩 刘晓雯 纵亮 朱一鸣 韩冰 郭玉芬

·临床研究·

甘肃省特有少数民族耳聋人群中GJB2基因突变分析*

边盼盼1徐百成1马建鹂1杨小龙1李倩2刘晓雯1纵亮2朱一鸣1韩冰2郭玉芬1

目的探讨GJB2基因突变在甘肃省特有少数民族耳聋人群中的分布，并分析其民族特异性。方法

在签署知情同意书的前提下，采集甘肃省特有的东乡族、保安族及裕固族中184例重度至极重度感音神经性聋患者的外周静脉血，提取DNA，针对GJB2基因的编码区行PCR扩增及DNA序列测定，分析GJB2基因突变在这三个民族耳聋患者中的分布，并与已经完成的本地区464例汉族感音神经性聋患者的相应数据进行比较。结果GJB2基因在东乡族155例、裕固族12例、保安族17例和汉族464例耳聋患者中的致病等位基因频率分别为9.03%（28／310）、12.5%（3／24）、5.88%（2／34）、12.17%（113／928），三个特有少数民族与汉族均无统计学差异。c.235delC和c.299_300del AT是东乡族的热点突变，等位基因频率均为3.87%（12／310），在所有致病等位基因中占85.71%（24／28）。裕固族c.35del G的等位基因频率最高，为8.33%（2／24），汉族中c.235delC是热点突变，等位基因频率为10.35%（96／928），东乡族c.299_300del AT和裕固族c.35delG的等位基因频率［分别为30.87%（12／310）、8.33%（2／310］均高于汉族［分别为0.43%（4／928）、0.54%（5／928）］。结论 在甘肃省特有的东乡族、保安族和裕固族非综合征型聋患者中GJB2基因突变具有相似的分布且与汉族类似；东乡族与裕固族GJB2基因的热点突变与汉族不同。

耳聋； GJB2； 少数民族； 突变

目前研究发现，GJB2基因突变是遗传性非综合征型聋主要的分子病因之一［1，2］，其在非综合征型聋患者中的突变形式就有109种（http：／／davinci. crg.es／deafness／index.php？seccion＝mut_db＆db＝nonsynd＆nonsynd＝cx26mut，截止至2012-11 -1），其中显性突变9种，隐性突变90种，性质不明的突变10种。针对不同种族和民族耳聋人群的研究发现，GJB2基因突变频率和热点突变均存在较大的差异［3～6］。GJB2基因突变在汉族耳聋人群的致病等位基因频率较高［7，8］。

从民族起源来讲，甘肃省独有的东乡族、裕固族、保安族均具有自己独特的种族背景，本研究对这三个民族的耳聋人群进行GJB2基因分子流行病学调查分析，旨在了解甘肃省特有这三个少数民族耳聋人群中GJB2基因的突变频率、热点突变及其民族特异性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取甘肃省东乡族、保安族和裕固族聚居的临夏回族自治州各县、张掖市肃南裕固族自治县及甘肃省各特教学校的155例东乡族、17例保安族、12例裕固族和464例汉族的非综合征型聋患者为研究对象，所有患者均来自不同家庭并排除外、中耳病变所致的听力下降。东乡族患者中男98例，女57例，年龄3个月～76岁，平均28.27±18.5岁；裕固族患者中男8例，女4例，年龄4～63岁，平均31.14±21.64岁；保安族患者中男11例，女6例，年龄8～67岁，平均40.29±14.91岁；汉族患者男262例，女202例，年龄6～39岁，平均15±3.58岁。按照听力损失的国际标准分级（WHO1997）：东乡族患者中重度听力损失9例，重度9例，极重度137例；裕固族患者中重度听力损失2例，重度2例，极重度8例；保安族患者中重度听力损失1例，重度2例，极重度14例；汉族患者中度听力损失1例，中重度1例，重度50例，极重度412例。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 采用一对一问答方式询问家属并对患者进行全身体格检查及耳鼻咽喉专科检查后填写调查问卷［9］，问卷内容包括一般情况、耳聋发病史、耳部外伤史、药物史、新生儿期高危因素、全身其他系统情况（心脏病、骨骼发育、视力）、智力发育情况、母亲分娩史、家族史、其他遗传疾病史、外耳和中耳疾病史和听力学检查资料，并对怀疑有遗传性聋的患者绘制家系图谱。

1.2.2 听力检查 对大龄及成年耳聋患者运用Madsen纯音听力计行纯音听阈检查，对所有患者用美国智听公司Smart EP听觉诱发电位仪行听性脑干反应测试，同时行声导抗检查以排除中耳病变。

1.2.3 血样采集及DNA提取 在与患者家属签订知情同意书的前提下抽取每位患者外周静脉血约5 ml，混合2 ml ACD-EDTA抗凝剂静置冻存，4℃运送，期间避免震荡、溶血，保存于-20℃冰箱。用盐析法提取外周血白细胞DNA，TE溶解后用1%的琼脂糖凝胶电泳定性，并用Thermo Nanodrop 2000分光光度计进行DNA浓度和纯度的检测。配制浓度约为50 ng／μl的工作液保存于4℃备用，母液置于-20℃长期保存。

1.2.4 PCR扩增及产物测序 用配制的工作液进行GJB2编码序列的PCR扩增，扩增片段长度为970 bp，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后使用ABI3737XL测序仪进行扩增片段的DNA测序。使用DNAstar7.0软件进行GJB2基因突变位点的判读，总结分析各民族的致病等位基因频率。致病等位基因频率＝致病等位基因数／等位基因总数。

1.3 统计学方法 各民族间的致病等位基因频率运用SPSS 17.0软件采用两两比较的办法，进行卡方检验，ɑ＝0.05。

2 结果

2.1 东乡族耳聋患者GJB2基因突变的检测结果

155例耳聋患者中，12例明确为GJB2基因突变所致（9例纯合，3例复合杂合），4例为杂合突变，74例为其他已明确的多态或其他序列改变，65例无突变（表1）。东乡族共检测到5种已知致病突变形式，等位基因频率为9.03%（28／310），其中c.299_ 300del AT和c.235delC的等位基因频率最高，均为3.87%（12／310），占所有致病等位基因数的85.71%（24／28），是东乡族耳聋患者GJB2基因的热点突变（表2）。东乡族中c.299_300del AT的致病频率高于c.235del C，占所有致病突变的58.33%（7／12）（表1）。

表1 GJB2致病基因型在各民族的分布（例）

表2 GJB2基因突变等位基因频数在不同民族的分布（例）

2.2 裕固族耳聋患者GJB2基因突变的检测结果

12例耳聋患者中，1例明确为GJB2基因突变所致，基因型为235delC／35delG（表1）；1例为c.35delG杂合突变，6例为其他已明确的多态，4例无突变。致病等位基因频率为12.50%（3／24），其中c.35delG的等位基因频率为8.33%（2／24），占所有致病突变的66.7%（2／3）；占所有致病突变的66.67%（2／3）（表2）。

2.3 保安族耳聋患者GJB2基因突变的检测结果

在保安族17例耳聋患者中仅发现1例176_ 191del16／299_300del AT的复合杂合突变（表1），致病等位基因频率为5.88%（2／34）。

2.4 汉族耳聋患者GJB2基因突变的检测结果

464例耳聋患者中，37例明确为GJB2基因突变所致（均为纯合突变），39例为杂合突变，235例为其他已明确的多态或其他序列改变，153例无突变（表1）。致病等位基因频率为12.17%（113／928），其中c.235delC的突变频率最高，为10.35%（96／928）（表2）。

经统计学分析，东乡族、裕固族、保安族耳聋患者GJB2致病等位基因频率与汉族比较差异无统计学意义（P值分别为0.131、0.962、0.267，均为P＞0.05），东乡族c.299_300del AT等位基因频率显著高于汉族（P＜0.01）；东乡族c.235del C等位基因频率明显低于汉族（P＜0.01）；裕固族c.35delG的等位基因频率（8.33%，2／24）显著高于汉族（0.54%， 5／928）（P＜0.01）。

3 讨论

东乡族、保安族和裕固族是甘肃省特有少数民族，人口较少，相对聚居。民族信仰、经济模式和居住环境的特殊性决定了这些民族多为族内通婚，遗传信息的保守性较好。从文中结果看，东乡族、保安族和裕固族的GJB2致病等位基因频率分别为9.03%、5.88%和12.50%，且三个民族之间以及各民族与汉族之间差异均无统计学意义，说明GJB2基因突变在甘肃省特有少数民族的耳聋病因中占有重要地位。

很多研究结果提示GJB2基因突变频率及热点突变具有种族特异性和民族特异性。伊朗南部高加索人种GJB2基因的突变频率为15%，c.35delG是其主要突变形式［3］；德系犹太人c.167del T高发［4］；非洲尼格罗人种c.427C＞T的等位基因频率较高［5］；中国西北地区（蒙古人种）针对多民族的研究中GJB2致病等位基因频率为14.2%，c.235delC是其主要突变形式，等位基因突变频率为9.8%［6］；韩国朝鲜族和日本大和民族c.235delC的等位基因突变频率分别为9.3%和3.9%［10］。

本组对象中，东乡族非综合征型聋患者的GJB2基因的主要突变形式与汉族类似，均为c.299_ 300del AT和c.235delC，但c.299_300del AT等位基因频率高于汉族（P＜0.01），c.235delC等位基因频率却低于汉族（P＜0.01）且东乡族中c.299_ 300del AT的突变频率高于c.235delC，占所有突变的58.33%（7／12），可见，c.299_300del AT是东乡族GJB2基因最主要的突变形式。

追溯东乡族的起源，在蒙古人说、混合说和回回色目人说即撒尔塔人说三种学说中，为学术界和东乡族本民族认可的是撒尔塔人为主说［11］。撒尔塔人即是以突厥人为主，并融合了蒙古等其他少数民族，突厥人属于黄白混血人种，即蒙古利亚人与高加索人的融合，因此东乡族的遗传信息应该继承了蒙古利亚人和高加索人的特点。蒙古利亚人的热点突变是c.235delC（占绝对优势）和c.299_ 300del AT［8］，高加索人的热点突变是c.35delG［12］，所以民族起源并不能完全解释c.299_300del AT在东乡族非综合征型聋患者中突变率如此高的现象。研究显示［13］，c.71G＞A是印度人群中GJB2基因的主要突变形式，占所有突变形式的95%，未见高加索人种的c.35delG和c.167del T热点突变。但印度人是雅利安人，属于高加索人种，说明不同地域同一人种的突变形式可能存在差异。从遗传学原理来讲，疾病的表型除了与基因突变有关外，还同基因与环境等外在因素的相互作用有关。由此推论东乡族非综合征型聋患者GJB2基因的热点突变是人种、地域环境差异以及种族迁徙演变等多种原因作用的结果，但仍需进一步研究。

2003年Rothrock等［14］利用微卫星标记、PCR等方法对来自意大利、巴西、北美具有c.35delG突变的人群进行SNP基因型分析，发现了一些相同且比较罕见的与c.35delG相关的SNP改变，为c.35delG突变的连锁不平衡提供了证据，也为c.35delG突变在高加索人种中高发的原因是始祖效应这一论点提供了证据。此外Van Laer等［15］的研究也支持上一观点。c.35del G是法国、希腊、伊朗等高加索人种的热点突变，在中国、日本等蒙古利亚人种的突变率普遍较低［11］，而本研究结果显示裕固族耳聋患者中c.35del G占所有致病突变的66.67%（2／3），是热点突变。裕固族起源于古代回鹘（回纥，Uyghur），具有明显的高加索种族背景［16］，以往对于同是回鹘起源的维吾尔族人的研究中c.35delG的突变频率也明显高于汉族［8］。可见，GJB2基因的热点突变c.35delG是始祖效应在具有高加索种族背景的裕固族中的典型表现。

本研究中保安族共检测到两个致病等位基因，分别为c.299_300del AT和c.176_191del16，并不能得出有关热点突变的明确结论，这与本民族人口基数少、耳聋人群少有关。

根据以上研究可知在东乡族、保安族和裕固族非综合征型聋人群中GJB2基因致病分布情况与汉族无差异。但东乡族和裕固族的热点突变情况却不同于汉族。东乡族的热点突变是c.299_300del AT和c.235delC，两者具有相同等位基因频率；裕固族中c.35delG是热点突变。说明GJB2基因突变在甘肃省特有少数民族非综合征型聋人群中的致病情况具有民族特异性。

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16 钱伯泉.黄头回纥的变迁及名义［J］.新疆社会科学，2004，6：98.

（2012-12-20收稿）

（本文编辑 雷培香）

A Study of GJB2 Gene Mutation in Deaf People From Sole Minority Nationalities ln Gansu Province

Bian Panpan，Xu Baicheng，Ma Jianli，Yang Xiaolong，Li Qian，Liu Xiaowen，Zong Liang，Zhu Yiming，Han Bing，Guo Yufen
（Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou，730030，China）

Objective To understand the prevalence of GJB2 gene mutation and to analyze the specificity of deaf people from sole minority nationalities in Gansu province.Methods Peripheral blood samples were obtained from people with moderately severe to profound sensorineural hearing loss（NSHL）in Dongxiang，Yugur and Bonan aren in Gansu province to extract genomic DNA.The codings of GJB2 gene were analyzed by PCR and direct sequencing，and compared with the data of 464 patients with SNHL from ethnic Han in Gansu.Results GJB2 gene Plutation was detated in 155 cases in 9.03%（28／310）Dongxiang，12 cases in 12.5%（3／24）Yugur，17 cases in 5. 88%（2／34）Bonan and 464 cases in 12.17%（113／928）Han，respectively.There was no difference of among each sole minority nationality and ethnic Han.The allele frequency of c.235delC and c.299_300del AT which were the main mutations while，ethnic Dongxiang，were both 3.87%（12／310），accounted for 85.7%in all pathogenic mutated alleles.c.35delG was the highest allele frequency which was 8.33%（2／24）in ethnic Yugur，and c.235delC wasthe most common mutation in ethnic Han with，the allele frequency of 10.35%（96／928），which was it is higher than those the allele frequencis of c.299_300del AT in ethnic Dongxiang and c.35del G in ethnic Yugur.Conclusion The prevalence of GJB2 gene mutation in sole minority nationalities in Gansu province is similor with that of in ethnic Han.National specificity exists between ethnic Dongxiang，Yugur and Han in mutation hotspots of GJB2 gene.

Deafness； GJB2； Minority nationalilies

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.002

时间：2013-5-9 13：58

R764.43

A

1006-7299（2013）04-0331-04

* 国家自然科学基金（81172765，30771857）、国家自然基金重大国际合作项目（81120108009）、全军“十二五”重点项目（BWS11J026）联合资助

1 兰州大学第二医院耳鼻咽喉-头颈外科（兰州 730030）； 2 解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科、解放军耳鼻咽喉研究所

边盼盼，女，内蒙古人，硕士，主要从事耳聋防治研究。

郭玉芬（Email：gyflhmm＠yahoo.cn）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130509.1358.002.html