肌酐酶法与碱性苦味酸法测定尿中肌酐含量的对比分析

王凯 彭珊茁 郑晓梅 魏明至

肌酐被用于尿液中毒物含量检测的校正。在一般情况下饮食、饮水量和利尿剂对肌酐的排出率没有太大影响，每日的变化很小。用肌酐量来表示被测物浓度水平与接触浓度有较好的相关性。目前，尿肌酐测定的行业标准为碱性苦味酸分光光度测定法［1］(WS/T 97-1996)。该方法为手工法，与全自动化的肌酐酶法相比较，操作繁琐且效率较低。作者通过试验对比，肌酐酶法可以替代碱性苦味酸法用于尿肌酐含量的测定。

1 资料与方法

1.1 碱性苦味酸法

1.1.1 仪器 UV2100紫外-可见光分光光度计(北京莱伯泰科)。

1.1.2 试剂 约15 g/L饱和苦味酸溶液(临用前过滤);100 g/L氢氧化钠溶液;碱性饱和苦味酸溶液(氢氧化钠溶液+饱和苦味酸上清液=1+10，临用前配制);0.1 mol/L盐酸(GR级);肌酐贮备液(经110℃干燥2 h的肌酐100 mg，以盐酸溶液稀释至100 ml，配成浓度1.0 mg/ml肌酐贮备液);肌酐标准液(肌酐贮备液用水稀释成0.1 mg/ml的标准溶液);肌酐标准曲线(分别取标准液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml，加水至3 ml，再向各管加入2 ml碱性苦味酸溶液，混匀，于室温下反应 20 ～30 min，加水 5 ml，混匀，配制成浓度为 0、1、2、3、4、5 μg/ml标准应用液);试验用水全部为超纯水。

1.1.3 原理 肌酐与过量苦味酸在碱性条件下反应生成橙红色苦味酸肌酐。在波长490nm处比色定量。

1.1.4 方法 取25 μl尿样置于10 ml比色管中，加水至3 ml，空白直接加3 ml水。向各管加入2 ml碱性苦味酸溶液，混匀，于室温下反应20～30 min，加水5 ml，混匀。在波长490 nm下测吸光度，在0.5 h内比色完毕。

1.2 肌酐酶法

1.2.1 仪器 TBA-120FR全自动生化分析仪(日本东芝)。

1.2.2 试剂 肌酐试剂盒(北京九强生物技术有限公司，批号08-0222);0.85%生理盐水(0.85 g氯化钠溶于100 ml水中);试验用水为蒸馏水。

1.2.3 原理 第一反应，消除样品中的内源性肌酸及肌氨酸。第二反应，样品中的肌酐在肌酐酶的作用下生成肌酸。然后，在肌酸酶和肌氨酸氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下生成醌类色素，以测定肌酐浓度。

1.2.4 方法 取20 μl尿样，以0.85%生理盐水稀释至1 ml，混匀后，上机测定。

1.3 样品 留取随机新鲜尿样，立即用两方法同时测定，每批测定均在1 h内完成。

2 结果

以两种方法分别同时测定52例样品，测定结果见表1。

表1 尿肌酐测定结果

两种方法测定结果的正态性检验见表2，均为正态分布。

表2 正态性检验结果

两种方法的相关系数r=0.839，P＜0.0005，相关系数有高度显著性，两方法一致度良好。对两种方法结果进行配对t检验，t=-1.255，P=0.215，两组数据无显著性差异，二者不存在方法学误差。

3 讨论

3.1 线性范围 肌酐酶法给定线性范围为0-15 μg/ml，在本实验室条件下，可以做到15 μg/ml。苦味酸法标准中给定线性范围为 0 ～1000 μg/ml，给定的标准系列浓度为 0、200、400、600、800、1000 μg/ml。但按照其给出的标准系列配制步骤，从标准贮备液算起，实际配制的标准系列浓度应为0、2、4、6、8、10 μg/ml，相差了 100 倍，不知为何原因。在本实验室条件下，苦味酸法的线性范围为0～6 μg/ml。所以，在本试验中，肌酐酶法的线性范围明显高于苦味酸法。

3.2 尿样稀释倍数 肌酐酶法要求尿样稀释50倍，在本试验中，在此稀释倍数下，绝大多数样品测定值均落入标准曲线线性范围内(0～15 μg/ml)，其余少数样品至多稀释100倍。苦味酸法标准中尿样稀释100倍，但在本试验中，在此稀释倍数下，绝大多数样品测定值均在线性范围之外(0～6 μg/ml)。约60%的尿样稀释400倍，结果可落在线性范围内。所以，在本试验中，苦味酸法的样品稀释倍数明显高于肌酐酶法。稀释倍数越大，测定结果的误差也越大。

3.3 苦味酸法中超线性测定值再次稀释的问题 超出线性范围的样品需再次稀释测定。标准方法中未注明超线性的结果用什么稀释，因其均以水定容，故本试验均以水做稀释剂。在试验中发现，再次稀释样品的测定值要低于直接稀释至线性范围内的测定值。具体试验如下:选取10份尿样，分别同时进行两种处理:A组直接稀释400倍，按标准方法处理后测定，结果均处于线性范围内;B组稀释200倍，按标准方法处理后测定，结果均超出线性范围，再以水将样品稀释2倍后测定，结果处于线性范围内。对两组数据进行配对t检验(表3)，有显著性差异，再次稀释组(B)测定值低于直接测定组(A)。

表3 尿肌酐测定值

基于上述结果作者认为，苦味酸法中再次稀释对尿肌酐测定有影响。为严格控制实验条件，本试验的52份数据均为一次测定就落入线性范围内的数据，经再次稀释而得出的测定结果均没有采用。

苦味酸法易受葡萄糖、维C、胆红素等非肌酐色素原的干扰。肌酐酶法特异性好，是解决肌酐测定种非特异性干扰的根本途径［2］。肌酐酶法操作简单，快速，受限制条件较少，在大批量样品检测中效率明显高于苦味酸法，是可以替代苦味酸法的尿肌酐测定方法。

［1］WS/T 97-1996.尿中肌酐分光光度测定方法.

［2］中华人民共和国卫生部医政司.第3版.全国临床检验操作规程，2006:465-468.