组织芯片在前列腺癌研究中的可靠性分析

李江 张炜明 邱梁 邱雁

组织芯片在前列腺癌研究中的可靠性分析

李江 张炜明 邱梁 邱雁

目的探讨前列腺癌组织芯片结果的可靠性。方法收集48例前列腺癌病例，构建成直径2.0 mm的组织芯片，进行HE染色并重新评价Gleason得分，同时应用免疫组化、原位杂交技术分别检测EZH2，并对照常规石蜡组织切片结果，进行统计学分析。结果前列腺癌组织芯片Gleason评分与常规石蜡切片比较，两者总体符合率为89.58%。前列腺癌组织芯片与常规石蜡切片比较，免疫组化结果一致率为95.65%（Kappa＝0.810）；原位杂交结果一致率为90.90%（Kappa＝0.727）。结论采用规范的组织芯片制作程序，直径2.0 mm组织芯片上的组织样本可以反映原组织结构的信息，可作为一种可靠的、有代表性的高通量组织分子分析工具用于前列腺癌大样本、回顾性的临床病理学研究。

前列腺癌；组织芯片；免疫组化；原位杂交；EZH2

前列腺癌占欧美国家男性主要死亡原因第二位，近年来随着人口老龄化，我国前列腺癌发病率也呈明显上升趋势。临床上亟待一种敏感的技术对前列腺癌早期诊断、治疗、演进趋势及预后进行评价，增加对前列腺癌本质的认识。随着生物技术的不断发展和新的检测工具如基因芯片和蛋白芯片的广泛应用于肿瘤研究，新的基因和蛋白分子不断被发现，然而对其功能的进一步研究，还应回到组织学水平。因而，先进的组织学研究方法——组织芯片技术就显得尤为重要。组织芯片在肿瘤研究中具有高通量、多样本、省时快速、简便经济等优点［1］，但由于芯片上每个位点大小有限，同时前列腺癌细胞具有较大的异质性，因此本文通过组织芯片与常规切片HE染色、免疫组化及原位杂交的结果比较对其进行可行性分析。

1 对象与方法

1.1 供体蜡块的选择 选择南京医科大学第一附属医院病理科2005～2007年前列腺癌根治手术标本48例，患者年龄50～81岁，平均（67.5±7.4）岁，术前均未接受过放疗或化疗，标本离体后均经4%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，所收集病例均为前列腺腺泡癌，根据前列腺癌Gleason评分系统，Gleason≤6分18例，Gleason评分≥7分30例。

1.2前列腺癌组织芯片的构建 复习HE切片，在相应的蜡块上标记具有代表性的区域1～2个，参考文献［2］，用组织芯片点样仪（Beecher Instruments公司）在空白蜡块上打孔，每个组织芯直径2.0 mm，再在肿瘤蜡块已做标记的区域钻取组织芯植入空白蜡块相对应的孔内，设计组织陈列点数共68个。待全部组织芯植入后，将组织芯片蜡块置55℃烘烤2 h，使组织芯与受体蜡块完全融合。冷却至室温后，冻存30 min，作4 μm连续切片，多聚赖氨酸玻片（福州迈新公司）捞片，62℃烘烤3 h，备用。

1.3 免疫组化 采用EnVision二步法，高温高压抗原修复，DAB显色。试剂兔抗人多克隆抗体EZH2（克隆号6A10，浓缩型）购自美国Zymed公司，工作液浓度为1∶100，操作参考试剂盒说明书。

1.4 原位杂交 EZH2原位杂交mRNA试剂盒购自武汉博士德公司，地高辛标记的EZH2寡核苷酸探针由该公司合成，序列为：5′-CAGACTGGGAAGAAATCTGAGAAGGGACCAGTTTG-3′；5′-AAGTATGTCGGCATCGAAAGAGAAATGGAAATCCC-3′。原位杂交所使用蒸馏水、器皿均用DEPC水处理。以RNA酶预处理作为阴性对照。实验步骤严格参照产品说明书。常规切片脱蜡梯度乙醇水化；3%H2O2灭活内源性酶；3%胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段；后固定后，在41℃恒温箱中进行预杂交3 h及杂交过夜处理；在37℃环境中依次滴加封闭液30 min，生物素化鼠抗地高辛60 min，SABC 20 min，生物素化过氧化物酶20min；各步骤间用PBS或SSC液漂洗，最后DAB显色。苏木精复染、脱水、透明、封固。

1.5 结果判断

1.5.1 组织芯片与常规组织切片HE染色重新进行Gleason评分：采用双盲法，由两位病理科医师重新对每个组织芯进行Gleason评分并与相应常规石蜡切片Gleason评分比较，相同记为符合，否则为不符合。

1.5.2 组织芯片与常规组织切片免疫组化及原位杂交评价标准：EZH2蛋白阳性细胞胞核中呈现有棕黄色细颗粒。EZH2 mRNA阳性细胞胞质中呈现有棕黄色细颗粒。采用双盲法，由两位病理科医师对组织芯片上每个位点的免疫组化及原位杂交染色进行评价，分别记数每个位点高倍镜下100个细胞，取其平均数。阳性细胞数≤25%为阴性，＞25%为阳性。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件处理，结果一致性采用Kappa法分析。

2 结果

2.1 组织芯片的质量 制作阵列蜡块过程中，68个组织芯排列整齐，无一例缺失，用作HE染色、免疫组织化学实验过程中均有2片组织折叠，原位杂交实验过程中组织缺失1片，折叠2片，最终有效病例均为48例。

2.2 组织芯片HE染色结果 HE切片镜下每一组织芯均可见具有诊断意义的肿瘤组织结构，所有组织中，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，核质比清晰，细胞的形态结构基本清楚。

2.3 组织芯片与常规切片中Gleason评分结果比较重新评价前列腺癌组织芯片的Gleason评分结果见表1，组织芯片与常规HE切片Gleason得分进行比较，结果发现，两者总体符合率达到89.58%。

表1 组织芯片与常规HE切片染色中Gleason评分关系

2.4 组织芯片与常规切片免疫组化及原位杂交结果比较 EZH2蛋白、EZH2mRNA阳性信号分别定位于细胞核和细胞质，呈棕黄色颗粒或团块（图1，2）。组织芯片阳性结果与常规切片阳性结果进行比较发现，EZH2蛋白、EZH2 mRNA表达符合率分别为96.65%和90.90%。统计学分析Kappa系数分别为0.810、0.727，均在0.7以上，说明两者有较高的符合率，见表2。

图1 免疫组化结果（IHC，EnVision×200）

图2 原位杂交结果（ISH×200）

表2 组织芯片与常规切片EZH2蛋白、EZH2 mRNA结果比较（n）

3 讨论

组织芯片又称组织微阵列（tissue microarray，TMA），是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品粘贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上，形成组织微阵列。在同一反应条件下进行免疫组化、原位杂交、FISH和原位PCR等以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质的细胞来源、分布特征和表达差异等。虽然该技术已在科研中得到广泛应用，但组织芯片的代表性和有效性仍被人们关注。

本研究结果显示，无论在组织芯片还是常规切片中，EZH2蛋白和EZH2 mRNA的表达符合率均高于90%，Kappa系数均＞0.7。表明直径2.0 mm的组织芯片中每个组织样本，可以反映原始组织结构的信息，没有出现明显的偏差，从总体上是能够代表普通组织研究的。Manley等［3］收集了Michigan大学肿瘤研究小组1995～2001年的前列腺癌病例1300例，用TMA技术对PSA、E-cadherin、p27及ki-67免疫组化表达进行研究，同样取得了满意结果，进行临床、病理及分子水平的研究显示，组织芯片上并不是每一个组织芯都能完全代表原来的组织结构信息，但这细小的差异并不影响总体的结果，在统计学上没有意义。本实验中，EZH2免疫组化和原位杂交在组织芯片中分别有2例和4例与常规切片结果有差异，在有差异的这几例常规切片中，我们观察到在同一张切片中不同区域的癌细胞免疫组化和原位杂交染色的强弱及阳性细胞所占的百分数也有差别。另外在Gleason评分有差异的这几例中，我们观察到芯片中丢失了原来肿瘤部分信息，尤其在Gleason评分为5分、7分、9分中不符合率均较高，这些差异主要是由于肿瘤形态以及生物学特征的异质性造成的。即使同一个肿瘤，在不同的肿瘤细胞间生物标志的表达水平也不尽一致，特别在多组织起源的肿瘤中这个问题很难避免，此外还由于标本本身的客观性差异和阅片者主观判断的不稳定性造成的。

另外，组织芯片上标本位点的丢失也是影响检测结果可靠性的重要因素［4］。本实验中组织丢失和折叠，也不同程度影响了结果。以往的研究发现，在组织芯片切片和染色过程中会导致大约15%～30%的芯片位点标本的丢失［4］。为此，近年来有研究者就组织芯片检测前列腺癌中肿瘤标志物表达情况的有效性和可靠性进行了探讨［4］，建议增大样本组织或采取2点甚至多点取材，可有效减少组织芯片和常规组织标本检测结果的差异，提高组织芯片检测的可靠性和有效性。取材时，准确的组织定位是关键，其次用于芯片制作的组织样本应略厚于常规组织取材的样本厚度，以3.0 mm厚为宜［1］。此外，若用水漂浮裱片，水温过高易导致组织片移位。若使用石蜡切片辅助带移系统进行干裱片及紫外线灯烤片，同时再用0.1%E的多聚赖氨酸等预处理载玻片，能有效地避免制片过程中组织片的移位或脱落。组织芯片是否具有代表性以及实验结果的可靠性，组织芯片样本量及组织芯的面积的选择也很关键，尤其肿瘤分化程度的差异大或肿瘤的异质性明显时更为重要。研究认为，在直径为2.0 mm的组织片上有约100 000个细胞，而直径0.6 mm的组织片上仅有约30 000个细胞。在TMA设计中不是组织片的数量越多越好，目前，国际上常用的TMA的样本量多为60～100个，组织片的直径在2.0 mm左右［1］。

综上所述，本实验无论在HE染色还是免疫组化和原位杂交结果，通过对前列腺癌组织芯片和常规切片比较表明，直径为2.0 mm的组织芯可以代表原组织用于前列腺癌的实验研究。该技术为前列腺癌临床病理学研究提供了一种可靠的、快速、经济的高通量分析工具。

［1］ 燕晓雯，陈琴，石群立.组织芯片技术在病理学中的应用［J］.医学研究生学报，2003，16（4）：297-303.

［2］ 李江，范钦和，樊祥山，等.前列腺癌中EZH2 mRNA及蛋白表达与细胞增殖的关系［J］.临床与实验病理学杂志，2009，25（6）：615-618.

［3］ Manley S，Mucci NR，De Marzo AM，et al.Relational database structure to manage high-throughput tissue microarray data and images for pathology studies focusing on clinical outcome：the prostate specialized program of research excellencemode［J］.AM JPathol，2001，159（3）：837-843.

［4］ Mucci NR，Akdas G，Manely S，et al.Neuroendocrine expression in metastatic prostate cancer：evaluation of high throughput tissuemicroarrays to detect heterogeneous protein expression［J］.Hum Pathol，2000，31（4）：406-414.

Analysis of the reliability of tissuem icroarray in the research of prostate cancer

LI Jiang，QIU Liang，QIU Yan．Department of Pathology，Jiangsu Provincial Geriatrics Hospital，Nanjing 210024，China；ZHANGWei-ming．Departmentof Pathology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo study the reliability of tissue chip in the research of human prostate cancer.MethodsTissuemicroarray（TMA）with 2.0 mm in diameter tissue core was constructed from forty-eight cases of human prostate cancer.Gleason score was reevaluated by HE staining.EZH2 was detected by immunohistochemical（IHC）technique，and in situ hybridization（ISH）technique.At the same time the stains on the tissuemicroarrays were compared with that from the routine paraffin section.ResultsComparing the Gleason scores of prostate cancer tissue chip with that of routine paraffin section，the overall coincidence rate was 89.58%.Immunohistochemical results showed that the consistent rate of TMA and routine paraffin section was 95.65%（Kappa＝0.810）.The result in situ hybridization suggested that the consistent rate of TMA and routine paraffin section was 90.90%（Kappa＝0.727）.ConclusionsTissuemicroarrays with 2.0 mm in diameter tissue core can represent full tissue section，if the tissuemicroarrays are constructed as standard method.As a reliable and high-throughout tool it could be set on large sample and retrospective clinipathological research in the application of human prostate cancer.

prostate cancer；tissuemicroarray；imunohistochemistry；in situ hybridization；EZH2

R 737.25

A

10.3969／j.issn.1003-9198.2013.01.015

2012-02-23）

210024江苏省南京市，江苏省老年医院病理科（李江，邱梁，邱雁）；210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院病理科（张炜明）