野鸦椿水提物对大鼠慢性肝纤维化的影响

刘迪栋 文旭 汤勇 张浩然 周常娥 高辉

肝纤维化是慢性肝病的共同病理学改变，也是各种慢性肝脏疾病向肝硬化发展的必经阶段。近年研究表明，肝纤维化是一种可逆的病理阶段，只要在肝纤维化阶段进行合理治疗，可以逆转肝纤维化的进程，从而达到缓解甚至治愈。野鸦椿(Euscaphis Japonica)为省沽油科野鸦椿属植物，是一种落叶小乔木，分布于我国的暖温带地区，果实主要含异懈皮苷、矢车菊素-3-木糖-葡萄糖苷、紫云英甙、山柰酚-3-葡萄糖苷及槲皮素-3-葡萄糖苷等。

湘西地区使用其果实治疗肝炎、肝硬化历史悠久，取得了一定的疗效。目前，关于野鸦椿的肝纤维化保护作用尚未见报道。本实验主要观察野鸦椿对四氯化碳(CC14)所致大鼠慢性肝纤维化的肝保护作用，并初步探讨其作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂 SD雄性大鼠 50 只，体重(150±10)g，由吉首大学动物中心提供。采集自湖南吉首地区的野鸦椿成熟果实，制成每毫升含生药 4 g的水提物。秋水仙碱（昆明制药有限公司，批号：070732）。CC14分析纯（北京化工厂，批号：20080209）。透明质酸（批号：20090101）、层粘连蛋白（批号：20090108）、Ⅲ型前胶原蛋白肽（批号：20090105）放免试剂盒，均购自上海海研医学生物技术有限公司。大鼠转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒（武汉博士德公司）。

1.2 仪器与设备 TGL-16 G低温高速离心机（上海医用分析仪器厂），GC-911 型γ放射免疫计数器（中国科技大学科技实业总公司），EL301 型酶标仪（BIO-TEK公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立及药物处理 将实验大鼠随机分成 5 组，每组 10 只，即正常组、模型组、秋水仙碱组以及野鸦椿高、低剂量组。参考文献[1-2]造成大鼠肝纤维化模型，各组动物均饮用 350 mg/L苯巴比妥溶液两周，随后模型组及各给药组灌胃给予CCl4-橄榄油溶液（CCl4与橄榄油的容积比为 1∶1），首次每只大鼠给 0.08 mL，以后按 2 mL/kg给予，2 次/周，每周称重 1 次，调整剂量，总计给CCl4-橄榄油溶液 8 周。正常组给等体积橄榄油。

从给CCl4-橄榄油溶液第 4 周开始给药，秋水仙碱组给秋水仙碱 0.1 mg/kg，野鸦椿高、低剂量组分别给野鸦椿水提物 1 mL/kg和 0.2 mL/kg，以上药物使用时均用生理盐水稀释成 2 mL灌胃给药，连续 5 周，模型组及对照组给等体积生理盐水。

1.3.2 指标检测 给药结束后各组大鼠腹主动脉取血，离心取血清检查各项指标。放免法检查血清HA、LN、PⅢP，TGF-β1及TNF-α采用ELISA方法检查；肝组织病例采用HE染色方法。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS12.0 统计学软件进行处理，结果以均数±标准差（±s）表示，实验数据采用方差分析，组建比较用q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 野鸦椿水提物对肝纤维化大鼠血清指标的影响 模型组大鼠血清HA、LN及PⅢP浓度显著高于正常组，野鸦椿高、低剂量组均明显低于模型组；野鸦椿高剂量组HA、LN浓度与秋水仙碱组没有显著性差异，PⅢP则高于秋水仙碱组，而低剂量组HA、LN及PⅢP均高于秋水仙碱组；组间比较野鸦椿高剂量组HA、LN及PⅢP均显著低于低剂量组(见表1)。

表1 野鸦椿水提物对肝纤维化大鼠血清HA、LN及PⅢP的影响(±s，n=10)

表1 野鸦椿水提物对肝纤维化大鼠血清HA、LN及PⅢP的影响(±s，n=10)

注：b与正常组比较P＜0.01，c与正常组比较P＜0.01；f与模型组比较P＜0.01；h与秋水仙碱组比较P＜0.05；i与秋水仙碱组比较P＜0.01；l与野鸦椿低剂量组比较P＜0.01

组别 HA(μg/L) LN(μg/L) PⅢP(μg/L)正常组 84.2±12.86 23.49±4.93 17.43±2.16模型组 330.36±47.07 c 49.76±8.54 c 39.82±4.35 c秋水仙碱组 164.94±23.55 26.28±5.14 21.61±3.37野鸦椿低剂量组 185.35±28.15 cfi 42.35±7.93 cfi 32.01±4.18 cfi野鸦椿高剂量组 161.66±22.53 cfl 28.29±5.65 bfl 25.93±3.63 cfhl

2.2 野鸦椿水提物对肝纤维化大鼠血清TGF-β1及TNF-α的影响 模型组大鼠血清TGF-β1及浓度显著高于正常组，野鸦椿高、低剂量组两者浓度明显低于模型组；野鸦椿高剂量组TGF-β1浓度与秋水仙碱组没有显著性差异，而低剂量组则高于秋水仙碱组，野鸦椿高剂量组则显著低于低剂量组；野鸦椿高、低剂量组TNF-α浓度均高于秋水仙碱组，野鸦椿高剂量组则显著低于低剂量组(见表2)。

表2 野鸦椿水提物对大鼠血清TGF-β1 及TNF-α的影响(±s，n=10)

表2 野鸦椿水提物对大鼠血清TGF-β1 及TNF-α的影响(±s，n=10)

注：c与正常组比较P＜0.01；f与模型组比较P＜0.01；h与秋水仙碱组比较P＜0.05；i与秋水仙碱组比较P＜0.01；l与野鸦椿低剂量组比较P＜0.01

组别 TGF-β1(pg/L) TNF-α(μg/L)正常组 15.47±4.64 30.69±6.66模型组 39.43±10.32 c 199.53±32.84 c秋水仙碱组 18.23±7.53 77.79±18.65野鸦椿低剂量组 28.68±9.61 cfi 122.62±25.82 cfi野鸦椿高剂量组 20.57±7.17 cfl 85.81±18.49 cfhl

3 讨论

HA、LN、PⅢP是反映肝纤维化较为敏感和特异的指标，3 项联用更为客观、可靠，并可反应肝纤维化的不同阶段[3]。野鸦椿水提物高、低剂量组均可显著降低大鼠血清HA、LN、PⅢP的水平，且高剂量组三者水平均低于低剂量组，显示出一定的剂量依赖性。病理切片也显示野鸦椿水提物高、低剂量组肝细胞的炎症水肿、胶原纤维沉积等情况要好于模型组，这些都说明野鸦椿水提物具有良好的抗肝纤维化作用。其抗肝纤维化的作用可能与抑制TGF-β1及TNF-α表达有关。

TGF-β1是目前己知的重要致肝纤维化的细胞因子之一[4-6]。在肝脏中TGF-β1来源于窦内皮细胞、Kupffer细胞及肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)。TGF-β1在肝纤维化的起始和持续发展中起关键作用，能够促进HSC的增殖和活化[7]，促进细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成并抑制其降解[8-10]，能预示肝炎病情的进展，并可反映肝纤维化的程度。激活的HSC又可分泌TGF-β1[9]，导致恶性循环，使肝纤维化不断进展。野鸦椿水提物高、低剂量组均可显著降低大鼠血清TGF-β1的水平，从而抑制HSC等细胞的激活，使HSC合成ECM减少，并且也可能由于TGF-β1的减少而促进HSC等的凋亡，阻断肝纤维化的进程，而抑制TGF-β1的作用及促进HSC的凋亡是肝纤维化及肝硬化治疗的重要途径之一[11-12]。

TNF-α主要由单核巨噬细胞、HSC及Kupffer细胞等产生，对肝纤维化的启动及调控起重要作用[13-14]。不仅是重要的炎症介质，还可促进肝内纤维母细胞增殖、胶原合成[15]，更重要的是可促进HSC的活化、增殖和分泌ECM，同时也能促使活化的HSC自分泌多种细胞因子，如白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、TGF等，还与其他细胞因子如TGF-β、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、IL-1 等形成调节网络，共同导致肝纤维化[16-17]。而野鸦椿水提物高、低剂量组均可显著抑制大鼠血清TNF-α的升高，从而抑制炎症反应，抑制纤维母细胞的增殖，减少胶原纤维合成，抑制HSC的激活，使HSC合成ECM及TGF-β、PDGF、IL-1 减少，阻断肝纤维化的进程。野鸦椿水提物可使肝纤维化大鼠TGF-β1及TNF-α均降低，不但可使两者各自致肝纤维化作用得到抑制，更减少了两者致肝纤维化的协同作用，阻断肝纤维化形成的调节网络。

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