绿竹花发育相关基因BoAP3的克隆与分析

朱龙飞，徐英武，林新春

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

MADS-box基因家族是一类转录因子，最先从酵母的转录因子MCM1、拟南芥Arabidopsis thaliana的AG基因、金鱼草Antirrhinum majus的DEF（DEFICIEMNS）基因和人的转录因子SRF（SRF4）中鉴定出来，在决定植物开花时间和花形态建成中均起着非常重要的作用[1-3]。通过对拟南芥和金鱼草的研究，Bowman等[4]提出了花器官发育的ABC模型，将同源异型基因分成A，B和C等3类。花器官的性质便是由这3类同源异型基因所决定。A类基因独自作用形成萼片，A类和B类基因共同作用形成花瓣，B类和C类基因共同作用形成雄蕊，C类基因独自作用形成雌蕊。APETALA3（AP3）/DEFICIENS（DEF）为植物花器官发育B类基因，调控植物雄蕊的发育[5]，AP3及其同源基因根据其编码的蛋白质C端一段特异序列的不同可以分为3个基因系：paleoAP3系，eu-AP3系和TM6系[6]。近年来，AP3同源基因在很多物种中都得到了相关报道[7]，但在竹子中没有这类报道。竹类植物是多年生植物，也是重要的经济植物，竹子开花会造成竹林成片死亡的现象，对生态环境和社会经济带来很大的影响，因此，对竹子开花的研究具有十分重要的意义。本实验以绿竹Bambusa oldhamii组培苗为实验材料，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）技术获得了BoAP3基因的cDNA全长，利用生物信息学对其进行了分析，同时也对其表达模式进行了分析，旨在为进一步研究竹类花发育的分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

绿竹花芽和营养芽分别来自浙江农林大学组培室继代1周的开花试管苗和营养试管苗[8]，长度为1 cm左右。采用Trizol法提取其总核糖核酸（RNA），-70℃保存备用。

1.2 绿竹AP3基因的克隆与序列分析

按照Reverse Transcription System（日本TAKARA公司）反转录试剂盒说明书合成花芽cDNA第1链。通过网络搜索（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/），根据禾本科Poaceae AP3-like同源基因序列由Primer 5.0设计一段保守序列引物，上游引物为5′-CGGGGATCATGAAG AAGGCG-3′，下游引物为5′-TCATACTGCTCGATCCATAG-3′，由中国上海生工生物工程技术有限公司合成。根据扩增的保守序列设计 RACE引物，3′RACE第 1轮引物为 5′-TGATATCTGTGCCTGGG CTG-3′，第 2轮引物为：5′-TAGGCTGGTCCCGATGCCCT-3′。 5′RACE 第 1 轮引物为 5′-CCATCATCATGTTCTCCTCC-3′， 第 2 轮引物为 5′-CGCACGGGGATCATGAAGAA-3′。根据RACE结果设计开放阅读框（open reading frame，ORF）引物，上游引物为 5′-ATGGGGCGCGGCAAG-3′， 下游引物为 5′-TTAACCGAGGCGCAGGTCGC-3′。 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的条带采用凝胶回收试剂盒（中国上海生工）回收。将回收条带插入pMD-20T载体（日本TAKARA公司），热激法转化DH5α（日本TAKARA公司），在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑筛选，挑取正向克隆，摇菌过夜，利用质粒提取试剂盒提取质粒，酶切鉴定送到中国上海生工生物工程服务有限公司测序。测序结果在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上BLAST比对，用DNAMAN软件进行序列氨基酸编辑（图1），CLUSTAL软件采用Neighbor-Joining（NJ）分析方法进行系统进化分析，在此基础上用MEGA 4.0软件构建系统进化树。

1.3 绿竹BoAP3基因的定量表达分析

以提取的绿竹开花试管苗的花芽和不开花试管苗的营养芽为材料，提取总RNA，参照试剂说明书分别进行反转录，利用ABI-7500定量聚合酶链式反应（PCR）仪对绿竹上述部位AP3基因的表达进行定量分析。以绿竹Actin基因为内标，ABI-7500反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性 15 s，59℃退火 1 min，40个循环。Actin上游引物为5′-TGAGCTTCCTGATGGG CAAG-3′， 下游引物为 3′-CCTGATA TCCACGTCGCACTT-5′。 BoAP3上游引物为5′-GGAGGTTCGCCACAGGAA-3′， 下游引物为 5′-GCTCCTGCTGCAGGTTCT-3′。

图1 BoAP3推定氨基酸序列Figure1 Putative amino acid sequence of BoAP3

2 结果与分析

2.1 BoAP3序列分析

以禾本科保守序列设计引物扩增得到了180 bp的片段，3′RACE扩增得到了750 bp的片段，5′RACE扩增得到了300 bp的片段，将5′RACE和3′RACE获得的序列进行拼接，结果显示：该cDNA全长为998 bp，含有1个完整的ORF序列，长度为654 bp。核苷酸序列比对结果发现，该序列为AP3同源基因，该基因与水稻Oryza sativa，小麦Triticum aestivum，玉米Zea mays等植物的AP3基因序列有很高的同源性。DNAMAN分析显示，该片段编码218个氨基酸，蛋白分子量约为25.04 kD，等电点为8.97。Blastp结果显示：该蛋白属于MADS-box家族，具有植物MADS-box蛋白典型的特征，其编码肽链包含2个保守区（MADS盒和K区）和2个非保守区（I区和C区）（图1），氨基酸序列与来自其他单子叶植物的某些MADS盒基因高度同源，与水稻OsMADS16，玉米silky1以及小麦WAP3一致性（identity）分别为83.54%，82.72%和82.30%，与拟南芥AP3的一致性为43.62%。在MADS盒和K区的氨基酸序列非常保守（图 2）。在NCBI上查找已经克隆出来的11个不同物种的AP3同源基因，采用clustalx对这些基因作氨基酸序列比对，采用NJ法构建系统进化树（mega 4.0）分析显示，BoAP3与小麦AP3关系最近，其次为水稻AP3，与金鱼草DEF同源基因进化关系最远，序列分析表明BoAP3蛋白属于pale-oAP3 系（图 3）。

图2 BoAP3与其他物种相关MADS区蛋白氨基酸序列比较Figure2 Amino acid sequence comparison of BoAP3 and the related MADS domain proteins of other species

图3 基于MADS盒基因氨基酸序列构建的系统树分析Figure3 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequence of MADS-box genes

2.2 BoAP3表达分析

2.2.1 标准曲线的制作 使用PCR产物作为模板，逐级稀释10.0倍，做6个梯度，制作Actin和BoAP3的标准曲线。Actin和BoAP3的扩增曲线R2分别为1.000和0.998，表明模板重复性好，所采用的PCR体系和热循环体系条件可以得到稳定的实验结果。

2.2.2 BoAP3在花芽和营养芽中的表达水平 以同时继代1周的开花试管苗的花芽和营养试管苗的营养芽cDNA为模板，以Actin为内参，研究 BoAP3基因在花芽和营养芽中的相对表达情况（图4）。每个模板和引物组合做3个重复。每个引物和模板组合的Ct值的标准误差较小，表明重复性好，且Actin和BoAP3引物扩增的Ct值均落在标准曲线Ct值的区间。定量结果表明：BoAP3在花芽的表达量明显比营养芽高，是营养芽表达量的8.1倍。

图4 BoAP3基因在绿竹花芽和营养芽中的表达水平Figure4 Expression level of BoAP3 gene in flower buds and vegetative shoots of Bambusa oldhamii

3 结论与讨论

为了探讨MADS-box基因调节竹类花器官发育的作用，克隆得到绿竹中的AP3-like基因并命名为BoAP3，该基因具有MADS-box中B类基因的结构特征。依据基因C端序列的不同，AP3-like基因分为3个基因系，分别是paleoAP3系，eu-AP3系和TM6系。本研究中分离的BoAP3蛋白质序列与paleoAP3系最相近，具有paleoAP3基序（YGx-HDLRLA）[9-10]（图2），BoAP3与小麦、水稻等AP3-like同源基因所编码的氨基酸同源性达到80%以上，且在系统进化树上聚为一类。综上所述，可以确定BoAP3是B类AP3-like基因。

到目前为止，已经从多个物种中克隆得到了花发育相关的B类基因（图3），其表达模式有着显著的差异。拟南芥中，AP3基因在花器官发育的第2轮和第3轮表达[11]，而在金鱼草中DEF基因在花器官发育4轮中都有表达，在非花组织不表达[12]，玉米的silky1基因在花器官所有部位表达[13]，荧光定量PCR结果可以看出，绿竹开花试管苗花芽的表达量是不开花试管苗营养芽表达量的8.1倍，这一结果表明BoAP3与花器官发育有密切关系。

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