三叶青水提物体内、体外抗肿瘤作用的研究

丁 丽， 纪其雄， 吕雯婷， 王玉连

（浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100）

三叶青水提物体内、体外抗肿瘤作用的研究

丁 丽， 纪其雄， 吕雯婷， 王玉连

（浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100）

目的 考察三叶青水提物体内、体外抗肿瘤的作用。方法 应用中药血清药理学方法，制备三叶青水提物的含药血清。采用MTT法观察不同质量浓度三叶青水提物及其含药血清对人宫颈癌细胞Hela229和人恶性黑色素瘤细胞A375细胞的体外抑制作用；以小鼠S180肉瘤为模型，观察三叶青水提物在体内对肿瘤生长的抑制作用。结果 三叶青水提物对Hela229和A375细胞有增殖抑制作用，且呈现出剂量依赖性，IC50分别为45.60 g/L和38.35 g/L；三叶青水提物含药血清高、中、低 （20，10，5 g/kg）剂量组也可抑制Hela229和A375细胞的体外增殖，IC50分别为41.82 g/L和248.60 g/L，呈现出剂量依赖性；三叶青水提物在体内对小鼠S180肉瘤的生长具有一定的抑制作用，高、中、低（24，12，6 g/kg）剂量组的抑瘤率分别为28.24%、41.56%和6.00%。结论 三叶青水提物体内、体外均具有抗肿瘤作用。

三叶青；水提物；抗肿瘤；含药血清；Hela229细胞；A375细胞；S180

三叶青Tetrastigma hemsleyanum是葡萄科植物，以块根或全草入药，在浙江地区常被用来治疗小儿惊厥高热、肺炎、支气管炎、肝炎及病毒性脑膜炎等症［1］。有报道称三叶青对多种肿瘤细胞有抑制作用［2-6］。本课题组前期研究结果也发现，三叶青石油醚和三氯甲烷两个提取部位对A375、Hela229、5637及AGS等肿瘤细胞表现出较强的抑制作用［7］，三叶青的三氯甲烷提取部位还能抑制A375细胞中黑色素的合成［8］。还发现三叶青水提物及其小鼠含药血清对人胃腺癌细胞株AGS肿瘤细胞有较强地体外抑制作用。因此，本实验进一步研究了三叶青水提物及其含药血清对Hela229和A375细胞的体外抑制作用，并以S180荷瘤小鼠为模型进行了体内抗肿瘤实验，为三叶青抗肿瘤的作用机制及活性成分的研究提供依据。

1 材料

1.1 药材 三叶青块根饮片购自宁波市鄞州医药药材公司，经浙江医药高等专科学校中药系杨雄志教授鉴定为Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg。

1.2 细胞株 人宫颈癌细胞株Hela 229、人恶性黑色素瘤细胞株A375和小鼠S180肉瘤细胞由本校细胞实验室冻存。

1.3 动物 清洁级昆明种小鼠，雄性，体质量 （18～26）g，购自浙江省实验动物中心，许可证号 SCXK（浙）20080033。

1.4 仪器与试药 iMark酶标仪 （美国Bio-Rad公司），AE21型倒置生物显微镜 （Motic中国公司），HF160W型CO2培养箱 （中国力申科学仪器有限公司）。MTT购于美国Amresco公司；RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司；胎牛血清购于上海蓝季科技发展有限公司；胰岛素购自上海蓝季科技发展有限公司；注射用环磷酰胺购自山西普德药业有限公司。

2 方法

2.1 药物配制

2.1.1 三叶青水提物制备 取三叶青饮片，碾碎，加水适量，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，过滤，弃去药渣，滤液浓缩，挥去溶剂得三叶青水提物 （每1 g三叶青水提物相当于1.43 g饮片），备用。

2.1.2 细胞抑制试验供试液制备 取三叶青水提物适量，加水适量溶解，离心，取上清液浓缩至生药含有量为1.0 g/mL的供试溶液，调节其pH值为 7.0～7.2，分别用含10%（体积分数）小牛血清的培养液稀释制成质量浓度为20、40、60、80、100 g/L的溶液，过滤除菌，备用。

2.1.3 小鼠含药血清制备 随机将小鼠分为5组，每组20只，分别为三叶青水提物高、中、低剂量组［9］（分别相当饮片20、10、5 g/kg），阳性对照 （注射用环磷酰胺，0.1 g/kg）组及阴性对照组。各组均灌胃给药 （阴性对照组给予蒸馏水［10］），每次20 mL/kg，连续3 d，每天2次，最后1次给药前禁食12 h，灌胃1 h后断头取血，分离血清，56℃灭活30 min后，过滤除菌，冷冻保存备用。

2.2 细胞培养 Hela 229和A375以含10%（体积分数）灭活小牛血清的RPMI1640培养液，在37℃，含5%（体积分数）的CO2，饱湿条件下培养。

2.3 体外抑制试验 （MTT法） 取对数生长期的Hela 229和A375细胞接种于96孔培养板，细胞密度为2.5×104个/L，每孔200 μL；24 h后，吸除培养板内原培养液，每孔加入不同质量浓度的三叶青水提物溶液或含药血清各200 μL，前者以每孔200 μL含10%小牛血清的培养液为空白对照，后者以每孔200 μL含10%阴性对照组血清但不含细胞的培养液为空白对照，以每孔200 μL含10%（体积分数）含药血清的培养液为阴性对照，每剂量组均设6复孔，37℃、5%（体积分数）CO2、饱湿条件下培养48 h后，每孔加入MTT液 （5 g/L）20 μL，4 h后，吸除上清液，加入150 μL DMSO终止反应，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度 （A）值。计算抑制率 （%）。

细胞抑制率（%）=（1－A药物/A对照）×100%

2.4 体内抗肿瘤试验 取腹腔接种7～9 d生长良好的荷S180小鼠4～5只，断颈处死。无菌抽取1～2 mL腹水，再用无菌生理盐水按1∶3比例稀释成瘤细胞悬液，并用0.4%苔盼蓝染色，计活细胞率＞90%，调整瘤细胞密度为1×107个/mL。取50只小鼠，每只小鼠右前肢腋下皮下接种0.2 mL。接种次日，按体质量随机分成5组，每组10只。阴性对照组灌胃给予等体积的蒸馏水；阳性对照组腹腔注射用环磷酰胺0.02 g/（kg·d）；三叶青水提物高、中、低剂量组分别灌胃给予相当于饮片24、12、6 g/（kg·d）的药物。每日1次，连续10 d。末次给药24 h后称质量，脱臼处死动物，剪开肿瘤部位，完整剥离瘤块，用滤纸吸净其上血和液体，称取瘤块质量，计算抑瘤率。并且分离胸腺和脾脏，精密称定质量，计算胸腺和脾脏指数。

3 结果

3.1 三叶青水提物对Hela 229和A375细胞的抑制作用实验结果显示，与阴性对照组比较，一定质量浓度范围的三叶青水提物和环磷酰胺处理48 h的Hela 229和A375细胞抑制率随质量浓度的增加均有显著地升高 （P＜0.01）（见表1）。Hela 229和 A375肿瘤细胞 IC50分别为45.60 g/L和 38.35 g/L。

表1 三叶青水提物对Hela229和A375细胞的抑制作用 （±s，n=6）

表1 三叶青水提物对Hela229和A375细胞的抑制作用 （±s，n=6）

注：和阴性组比较，#P＜0.01（表2、表3同）。

组 别 质量浓度/（g·L－1）Hela229 A375抑制率/% IC50/（g· L－1） 抑制率/% IC50/（g·L－1）阴性对照00000三叶青水提物 1 5.79±5.50 10.72±10.77 20 25.81±8.1# 26.19±11.00 40 44.93±8.60#45.60 50.69±12.13#60 56.31±4.19# 82.06±9.28#80 95.43±0.45# 95.03±6.49#100 97.31±0.29# 98.51±0.45#注射用环磷酰胺 0.1 70.48±5.45# － 79.77±5.46#38.35－

3.2 三叶青水提物含药血清对Hela 229和A375细胞的抑制作用 结果见表2。与阴性对照组比较，三叶青水提物含药血清对Hela 229和A375细胞具有显著地抑制作用 （P＜0.01），且呈剂量-效应关系，IC50分别为 41.82 g/L和248.60 g/L。Hela 229细胞对三叶青水提物高、中、低剂量组含药血清的敏感性与三叶青水提物直接作用于该细胞时的结果相似，而三叶青水提物含药血清对A375细胞抑制作用不如三叶青水提物。

表2 含药血清对Hela 229和A375细胞体外抑制作用的影响（x ± s，n=6）

3.3 体内肿瘤抑制试验 三叶青水提物高、中、低剂量组对小鼠S180肉瘤的抑制作用与阴性对照组比较，高、低剂量组无明显差异，而中剂量组表现出非常显著的差异 （P＜0.01）；与阴性对照组比较，各剂量组小鼠脾脏指数和胸指腺数均呈下降趋势，低剂量组与高剂量组下降较多，其胸腺指数有显著差异性 （P＜0.05）；中剂量组下降较少（P＞0.05）。见表3。

表3 三叶青水提物对荷S180小鼠肿瘤生长的抑制作用（x ± s，n=10）

4 讨论

有报道称从三叶青中分离得取了6'-O-苯甲酰基胡萝卜苷、胡萝卜苷、β-谷甾醇［10］、麦角醇、蒲公英萜酮［11］，山柰酚-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素［12］、5，7，4'-三羟基黄酮-6-α-L-吡喃鼠李糖 （1-4）-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，5，7，4'-三羟基黄酮-8-α-L-吡喃鼠李糖 （1-4）-α-L-吡喃阿拉伯糖苷和5，7，4'-三羟基黄酮-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷［13］。其中的6'-O-苯甲酰基胡萝卜苷、三叶青黄酮有抗肿瘤作用［3，5，10］。前期实验对三叶青脂溶性提取物做了体外肿瘤细胞抑制试验，发现其有较强的细胞毒作用［7-8］。有人从三叶青中提取出了多糖成分［14］，本课题组认为三叶青中可能存在水溶性的多糖成分，因此有必要研究三叶青水提物的抗肿瘤作用，便于以后全面研究三叶青中的抗肿瘤活性成分。三叶青水提物是粗制剂，体外试验受其中杂质的影响，可能会产生假阳性或假阴性的结果。所以本实验同时采用中药血清药理学的方法及小鼠体内、体外试验。

从本实验结果分析，三叶青水提物对Hela 229和A375细胞均有较强地体外抑制作用，采用中药血清药理学方法则发现三叶青含药血清对Hela 229仍表现出明显的细胞毒作用，而对A375细胞的抑制作用稍弱，但二者的抑制作用均呈剂量-效应关系。试验结果还表明，三叶青水提物对小鼠S180肉瘤的有一定地抑制作用，且不表现出剂量依赖性。中剂量组 （12 g/kg）的抗肿瘤作用优于高剂量组 （24 g/kg）与低剂量组 （6 g/kg）；与阴性对照组比较，其脾脏指数与胸腺指数均有所下降，提示三叶青水提物可能含有毒性作用的杂质，或者三叶青水提物本身可能具有毒性。

本实验通过体内外抗肿瘤试验，表明三叶青具有明显的抗肿瘤活性。结果显示三叶青抗肿瘤的机制并不是通过提高宿主免疫功能的途径，其作用机理有待于进一步研究。另外三叶青的抗肿瘤活性成分还未知，作者将继续研究，为开发利用三叶青提供依据。

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R285.5

B

1001-1528（2013）05-1076-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.053

2012-10-22

浙江省教育厅2010年度科研项目 （Y201019049）

丁 丽 （1979—），女，硕士，讲师，研究方向：中药药效物质基础及中药药理学。E-mail：nbncdl@163.com