木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕制备小肽的研究

贾文倩，王舒怡，龚宽俊，李宝才，张惠芬，角仕云，秦 谊，*

（1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500；2.昆明理工大学化学工程学院，云南昆明650500）

小桐子（Jatropha curcas L.）为大戟科麻疯树属植物，是一种耐瘠抗旱的速生、多用途油料植物。因其种仁大，含油率高，被认为是发展生物柴油的最适宜树种[1]。2006年，国家林业局将小桐子作为林业生物质能源研发首选树种，主要用于生物能源的开发。据统计，我国目前人工种植的小桐子林木多达200万公顷，预计年产生物柴油500万t[2]。小桐子仁粕是小桐子种仁制备生物柴油后的副产品，完全脱脂的小桐子仁粕含40%～60%的粗蛋白，其中90%为真蛋白，且氨基酸组成平衡，是生产动物蛋白质饲料的优质原料[3-5]。由于含有植物凝集素、胰蛋白酶抑制剂、佛波醇酯等抗营养因子和毒素，小桐子仁粕不能被直接用作动物饲料，但随着脱毒技术的不断进步，目前小桐子仁粕中的大部分毒素已经可以被有效脱除[4，6-8]。现代研究认为，蛋白质在动物消化酶作用下的水解终产物大部分是由2个或3个氨基酸残基组成的小肽，它们能完整地通过肠粘膜细胞进入体循环。同游离氨基酸相比，小肽的吸收具有转运速度快、耗能低、载体不易饱和等优点，同时它还可以促进机体对游离氨基酸及矿物质元素的吸收，提高蛋白质沉积率，因此，含有大量小肽的小肽饲料比传统的蛋白质饲料具有更优越的营养价值[9-10]。本研究应用木瓜蛋白酶水解小桐子仁粕蛋白质，产生小肽，以改善小桐子仁粕的营养性能。酶解产物可以直接作为小肽饲料饲养动物，也可以作为生产小肽饲料的原料或添加剂，提高动物对小桐子仁粕蛋白质的吸收利用率。该工艺绿色环保，操作简单且成本较低，可以直接生产出小肽饲料，具有大规模投入生产的潜力。以小桐子仁粕固体原料作为底物，直接进行酶解制备小肽的研究尚属首次报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小桐子种子 采自云南元江哈尼族彝族傣族自治县；木瓜蛋白酶 购自Sigma公司，4000U/mg；其他试剂均为分析纯；实验室用水 为蒸馏水。

FD-1A-50型冷冻干燥机 上海比朗仪器有限公司；PHS-2C型精密酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司；T2000Y型电子天平 美国双杰兄弟有限公司；HH-S6型多功能电子恒温水浴锅 江苏省医疗器械厂；HGT-2型干式恒温器 天津市恒奥科技发展有限公司；HG101-3型电热鼓风干燥箱 南京实验仪器厂；DL-5-B型低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 小桐子仁粕的制备与脱毒 参照文献[8，11]中的方法制备小桐子仁粕，同时进行脱毒。小桐子种子去壳取仁，粉碎后过80目筛，置于索氏提取器中用石油醚（60～90℃）进行脱脂；完全脱脂后，仁粕在室温下用90%乙醇浸提2h，料液比为1∶10。脱毒后的小桐子仁粕60℃真空干燥，测定水分、总蛋白质和小肽含量。

1.2.2 小桐子仁粕的酶解 称取小桐子仁粕，与适量的水、木瓜蛋白酶混匀，调节pH，放入设定温度的恒温箱中酶解，一段时间后取出，置于沸水浴中加热10min终止酶解反应。酶解产物60℃真空干燥后，测定水分、总蛋白质和小肽含量。

1.2.3 酶解工艺的优化 料液比、酶解温度、pH、加酶量和酶解时间为影响蛋白质酶解的主要因素。以酶解产物中小肽含量为指标，先通过单因素实验考察各因素对木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕的影响，确定各因素取值范围，在此基础上用正交实验对酶解工艺进行优化，最终确定木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕制备小肽的最佳工艺条件。正交实验因素和水平的取值由单因素实验确定，具体见表1。

表1 L9（34）正交实验因素水平表Table 1 The factors and 1evels of the L9（34）test

1.2.4 样品分析方法 小肽含量的测定（TCA法）参照行业标准QB/T 2879-2007：样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀物质，清液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为小肽含量[12]。总蛋白质和水分分别按照国家标准GB/T 6432-1994和GB/T 6435-1986测定[13-14]。样品中小肽含量占总蛋白质含量的比重为小肽百分比。

2 结果与分析

2.1 料液比的选择

在加酶量120U/g、pH6、温度50℃、酶解24h的条件下，考察料液比对小桐子仁粕酶解产物小肽含量的影响，结果如图1所示。开始时酶解产物中的小肽含量随料液比的减小而升高，当料液比为1∶3g/mL时，小肽含量最高，料液比继续减小时小肽含量下降，这可能是酶解产物中游离氨基酸增多所致。因此，最适料液比在1∶3g/mL左右。在此料液比条件时，小桐子仁粕酶解液为匀浆状混合物，既可以直接作为小肽饲料饲养动物，也可以干燥后作为饲料原料或添加剂使用。

图1 料液比对小肽含量的影响Fig.1 Influence of solid-liquid ratio on the content of small peptides

2.2 酶解温度的选择

在加酶量120U/g、料液比1∶3g/mL、pH6、酶解24h的条件下，考察酶解温度对小桐子仁粕酶解产物小肽含量的影响，结果如图2所示。开始时酶解产物中的小肽含量随温度的升高而升高，当温度达到50℃时，含量最高，之后温度继续上升，小肽含量反而呈下降趋势，这可能是酶活性在较高温度时受到抑制的缘故。因此，选择最适酶解温度在50℃左右。

图2 酶解温度对小肽含量的影响Fig.2 Influence of enzymolysis temperature on the content of small peptides

2.3 pH的选择

在加酶量120U/g、料液比1∶3g/mL、温度50℃、酶解24h的条件下，考察体系pH对小桐子仁粕酶解产物小肽含量的影响，结果如图3所示。木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕最适pH在5.0～5.5，pH为5.0时小肽含量最高，这也是木瓜蛋白酶的最适使用pH范围，酶解过程中pH过高或过低均会降低酶活性。

图3 pH对小肽含量的影响Fig.3 Influence of pH on the content of small peptides

2.4 加酶量的确定

在料液比1∶3g/mL、pH5、温度50℃、酶解24h的条件下，考察加酶量对小桐子仁粕酶解产物小肽含量的影响，结果如图4所示。小肽含量随着加酶量的增大而升高；在加酶量小于180U/g时，随着加酶量增加小肽含量显著提高；但当加酶量大于180U/g时小肽含量增加不明显，甚至出现下降。理论上，加酶量越高，底物与酶分子的接触机率就越高，反应越容易进行。但TCA法测定小肽的原理是样品中酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为小肽含量，加酶量过多不仅增加成本，而且可能使蛋白质过度水解产生更多游离氨基酸，最终导致小肽含量减少。因此，选择加酶量在180U/g左右较合理。

图4 加酶量对小肽含量的影响Fig.4 Influence of enzyme amount on the content of small peptides

2.5 酶解时间的选择

在加酶量180U/g、料液比1∶3g/mL、pH5、温度50℃的条件下，考察酶解时间对小桐子仁粕酶解产物小肽含量的影响，结果如图5所示。开始时酶解产物中的小肽含量随酶解时间的增加而明显升高，当酶解时间达到36h后，小肽含量出现下降趋势，这可能是过度酶解使产物中游离氨基酸增多所致。同时考虑到生产效率，酶解时间在36h左右较合适。

2.6 酶解工艺的优化

综合分析单因素实验，确定加酶量为180U/g，选取对酶解产物中小肽含量影响较大的四个因素（酶解时间、料液比、pH、酶解温度）进一步通过L9（34）正交实验对酶解工艺进行优化，实验设计及结果如表2所示。通过极差分析可以看出，影响小桐子仁粕酶解产物小肽含量的各因素主次顺序为：A＞C＞D＞B，最佳酶解工艺为A2B2C3D2，即：酶解时间36h，料液比1∶3，pH5.5，酶解温度50℃。

图5 酶解时间对小肽含量的影响Fig.5 Influence of enzymolysis time on the content of small peptides

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

2.7 最佳工艺验证实验

在确定的最佳工艺条件下进行3次实验，所得酶解产物的小肽含量分别为218.28、213.06、220.91mg/g，平均值为217.42mg/g，相对标准偏差RSD为1.84%。

2.8 样品分析

表3 样品分析结果Table 3 The results of sample analysis

小桐子仁粕原料和最佳工艺条件下酶解产物的水分、粗蛋白和小肽的含量如表3所示。本研究的目的是酶解小桐子仁粕中的蛋白质生产小肽，因此并非蛋白质水解度越高越好，理想的效果是水解度较高，同时酶解产物中小肽的比重高，而游离氨基酸的比重低。在本实验的最佳酶解条件下，可以使底物中小肽占总蛋白质的比重从7.11%升高至39.68%。

3 结论

木瓜蛋白酶是一种高效蛋白水解酶，用于酶解小桐子仁粕可以获得较高产量的酶解产物——小肽。通过单因素和正交实验，得到最佳酶解工艺条件为：加酶量180U/g，酶解时间36h，料液比1∶3，pH5.5，酶解温度50℃，在此条件下酶解产物中的小肽含量可达217.42mg/g。同时，木瓜蛋白酶还具有酯酶的活性，对动植物中的酯、酰胺等也有较强的水解能力，这对促进小桐子仁粕中主要毒素佛波醇酯的水解，减少水解产物中残留毒性物质具有积极作用[15-16]。该工艺绿色环保，操作简单且成本较低，可以利用小桐子仁粕直接生产出小肽饲料，提高蛋白质的利用效率，这对于小桐子资源的综合利用以及缓解我国蛋白质饲料短缺具有重要的应用价值。

[1]吴远根，彭湘屏，张晓娟，等.产朊假丝酵母固态发酵麻疯树饼粕产菌体蛋白的研究[J].食品工业科技，2009，30（2）：161-164.

[2]张伶俐，苏勇，Makkar H，等.体外评估一种新型蛋白原料——麻疯树脱毒浓缩蛋白的营养价值[J].畜牧与兽医，2010，42（9）：57-59.

[3]Aregheore EM，Becker K，Makkar HPS.Detoxification of a toxic variety of Jatropha curcas using heat and chemical treatments，and preliminary nutritional evaluation with rats[J].South Pacific JournaI of Natural Science，2003，21（1）：50-56.

[4]马博，兰翠玲，李力.麻疯树籽饼粕饲用品质改良及深加工技术研究进展[J].中国油脂，2011，36（5）：26-30.

[5]Aderibigbe AO，Johnson COLE，Makkar HPS，et al.Chemical composition and effect of heat on organic matter-and nitrogendegradability and some antinutritional components of Jatropha meal[J].Animal Feed Science Technology，1997，67：223-243.

[6]Makkar HPS，Martínez-Herrera J，Becker K.Variation in seed number per fruit，seed physical parameters and contents of oil，protein and phorbol esters in toxic and non-toxic genotypes of Jatropha curcas[J].J Plant Sci，2008，3（3）：260-265.

[7]Kumar V，Makkar HPS，Amselgruber W，et al.Physiological，haematological and histopathological responses in common carp（Cyprinus carpio L.）fingerlings fed with differently detoxified Jatropha curcas kernel meal[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48（8-9）：2063-2072.

[8]张春强，刁其玉，屠焰，等.麻疯树籽实的毒性原理及其脱毒处理方法[J].饲料博览，2009（5）：29-31.

[9]郭玉东，张洋，张均国.小肽饲料营养价值及评价方法[J].饲料工业，2007，28（7）：13-16.

[10]袁书林，陈海燕，杨明君，等.小肽营养研究进展[J].粮食与饲料工业，2002（8）：37-39.

[11]Martínez-Herrera J，Siddhuraju P，Francis G，et al.Chemical composition， toxic/antimetabolic constituents， and effects of different treatments on their levels，in four provenances of Jatropha curcas L.from Mexico[J].Food Chemistry，2006，96（1）：80-89.

[12]中国轻工业联合会.QB/T 2879-2007海洋鱼低聚肽粉[S].北京：中国标准出版社，2007.

[13]中华人民共和国农业部.GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法[S].北京：中国标准出版社，1994.

[14]中华人民共和国农业部.GB/T 6435-1986饲料水分的测定方法[S].北京：中国标准出版社，1986.

[15]冯定远，陈芳艳.木瓜蛋白酶的酶学特性及其在饲料工业中的应用[J].饲料工业，2011，32（20）：1-5.

[16]凌兴汉，吴显荣.木瓜蛋白酶与番木瓜栽培[M].北京：中国农业出版社，1998：106-108.