甜叶菊中甜菊素提取工艺研究

2013-05-18凌立新张国芬陈凤鸣

食品工业科技 2013年6期

凌立新，张国芬，陈凤鸣

（1.重庆文理学院材料与化工学院，重庆永川402160；2.成都华高药业有限公司，四川成都610041）

甜叶菊为菊科植物甜叶菊的干燥叶，原产地在南美洲巴拉圭东北部与巴西接壤的阿曼拜山脉中，后来被引入中国[1]。甜叶菊化学成分多种多样，其中甜味成分是各种糖苷，其含量占10%以上，这些糖苷中，含量高，且有经济价值的糖苷体有甜菊苷（St）、莱鲍迪苷A（RA）、莱鲍迪苷C（RC）、杜尔可苷A（DA）四种[2-4]。甜菊素（又名甜菊糖苷，甜菊糖）为上述各种甜味苷类的总称，是以St（C38H60O18）为主的混合苷。甜菊素的甜度是蔗糖的200～300倍，其热量却只有蔗糖的1/300，经大量药物实验证明，甜菊素无毒副作用，无致癌物，安全性高[5]。甜菊素是天然高甜、低热的保健型甜味剂，可用于医药品的呈味改良剂和矫味剂，也可作为医药辅助治疗剂，是继蔗糖、甜菜糖之外第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被称为第三大天然糖源[6]。目前，国内生产甜菊素的厂家很多，提取主要采用醇提取法、吸附法、浸提法、树脂法、分子筛法等，应用最广的是树脂工艺法，工业产品含量一般只有90%～95%[7-8]。在国家日益加强食品、药品安全监管的今天，90%含量的产品显然难以满足药品生产企业对辅料的要求。本研究从药品辅料要求的角度为药品生产企业提供了生产符合药用标准（质量分数95.0%以上）要求产品的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜叶菊购于成都市荷花池中药材市场；离子交换树脂D001SD、D941 山东鲁抗树脂厂；乙醇食用级，成都恒祥化学试剂有限公司；甜菊苷对照品批号111515-200001，中国食品药品检定研究院。

DT-3m3多功能提取罐温州市大成药机制造有限公司；DWN-2000型外循环浓缩器成都信立制药化工设备有限公司；SJM-FHM型陶瓷复合膜设备合肥世杰膜工程有限责任公司；ZLG-100型喷雾干燥机江苏无锡现代干燥设备厂；MX-1E FT-IR红外仪 Nicolet，美国。

1.2 实验方法

1.2.1 制备工艺取已混合均匀的甜叶菊，称取600g，共称9份，按照2.1项中表2设定的参数分别回流提取，将不同方法得到的提取液分别减压回收乙醇后，通过膜过滤，滤液再依次通过相同体积的阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，阳、阴离子交换树脂都用相同体积、相同流速的50%（v/v）的乙醇洗脱，减压回收乙醇后浓缩至相对密度1.20（60℃）左右，再经醇沉、喷雾干燥，得产品。流程如图1所示。

图1 制备工艺流程Fig.1 Preparation process

1.2.2 提取工艺最优参数的确定在单因素实验时，以甜菊素收率为评价指标，依次考察提取剂乙醇浓度（v/v）、提取时间、溶剂用量（倍）和提取次数的影响，并确定4因素3水平的最佳参数进行正交实验分析。正交实验以甜菊素的收率为评价指标。正交实验因素水平表见表1。

表1 正交设计因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 产品质量评价[9]取制得的样品，按《中国药典》2010年版甜菊素品种项下要求测定，并按含量测定项下方法滴定，计算出产品中甜菊素的质量分数。

式中：C-乙醇制氢氧化钾滴定液的浓度（mol/L）；V-滴定时消耗的乙醇制氢氧化钾滴定液的体积（mL）；T-每1mL乙醇制氢氧化钾滴定液（0.05mol/L）相当于40.24mg的C38H60O18；m-测定时，称取制得的产品质量（g）。

1.2.4 收率的计算计算公式如下：

式中：W-测得的提取液中甜菊素的质量（g）；W0-甜叶菊的投料量（g）。

1.2.5 膜透过率的计算计算公式如下：

式中：W0-过膜终止时透过液体积（L）；C0-过膜终止时透过液中甜菊素的浓度（g/L）；W1-膜分离前提取液的体积（L）；C1-膜分离前提取液中甜菊素的浓度（g/L）。

2 结果与讨论

2.1 提取工艺参数选择

甜叶菊中苷类物质的提取，一般都采用水提法[10]。甜叶菊的水提取液中含有叶绿素、水溶性蛋白、果胶、丹宁、有机酸等杂质，这些杂质的含量是甜菊苷类含量的5～7倍，后续精制处理比较繁杂，也不易得到高含量的产品。另外，甜菊素在水中微溶，在乙醇中溶解，且在乙醇中的溶解度远大于水中的溶解度。因此，本实验采用一定浓度的乙醇溶液来进行提取，用乙醇溶液提取可减少叶中的淀粉、果胶等杂质随甜菊苷类一起进入提取液。

对影响产品收率的因素乙醇浓度（v/v）（A）、溶剂用量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）进行单因素实验，结果发现，乙醇的浓度（v/v）对甜菊素收率影响较大，见图2，在50%～95%范围内，随着乙醇浓度的增加，收率先呈明显上升后下降的趋势；在乙醇浓度为70%～90%范围时收率基本趋于不变；所以，在正交实验时乙醇浓度的水平选择了60%、75%和90%。

图2 不同乙醇浓度提取对甜菊素收率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the yield of steviosin

由于提取次数对提取成分收率的影响通常是显著的，往往会掩盖其他因素的影响，且考虑到大生产中提取通常为3次，再增加提取次数，提取液中杂质会增多，在工业上为节约工时，降低能耗，所以正交实验中提取次数选择为1、2、3次。

从图3可以看出，提取剂用量越大甜菊素收率越高，但12倍与16倍之间差别不大。考虑到工艺的实用性，当溶剂用量为16倍时，提取剂用量大，浓缩成本高。因此，正交实验中溶剂乙醇用量的水平第一次提取选择8倍、10倍和12倍，第二次、第三次提取以每次递减20%的方式进行。

图3 不同溶剂用量提取对甜菊素收率的影响Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the yield of steviosin

图4 提取时间对甜菊素收率的影响Fig.4 The effect of time on the yield of steviosin

从图4可以看出，随着提取时间的延长，甜菊素的收率呈上升趋势，3h后收率变化趋于平缓，故选择第一次提取时间为3、2.5、2h进行正交实验，以后每次提取时间递减0.5h。

根据以上的单因素实验，用正交实验L9（34）进行优选，以收率为指标进行方差分析。正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2中K1、K2、K3为相关水平所得收率的总和，R为极差。由表2和表3可见，极差分析和方差分析的结果一致，各种因素对产品收率的影响的主次顺序依次为：A＞D＞C＞B，影响最大的是乙醇浓度，其次是提取次数，最优提取工艺条件为A3B2C3D3。由直观分析表和方差分析表可以看出，溶剂用量、提取时间对本实验的影响较小，在实际工业生产中因素B选择1水平，因素C选择1水平。

综上分析，确定甜叶菊中提取甜菊素的优选工艺条件为A3B1C1D3，即采用90%（v/v）的乙醇，第一次加8倍量，第二、三次分别6倍、5倍；提取3次，第一次2h、第二、三次分别为1.5h和1h。经验证实验，如表4，最优工艺A3B2C3D3和优选工艺A3B1C1D3对比发现，实验结果相差不大，但考虑到优选工艺省时省工，可降低生产成本，故选择优选工艺条件A3B1C1D3为甜叶菊的提取工艺。在优选工艺条件下验证实验3次得到产品质量分数平均为75.4%，平均收率为7.82%。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Results of variance analysis

2.2 过滤膜的选择

表4 验证实验结果Table 4 Results of verification test

表5 甜菊素的透过率Table 5 Transmittance of steviosin

采用一定浓度的乙醇进行的提取，仍有较多杂质进入提取液，目前国内外除杂方法主要有醇沉法、高速离心法、大孔吸附树脂法及絮凝剂法[11]。本研究选择超滤法，它是甜菊素提取液除去大分子杂质的关键步骤。通过膜过滤方法，不会引入其他杂质和无机离子，减少了后续精制的负荷，克服了传统絮凝沉淀方法絮凝剂耗量大，絮凝反应和压滤澄清周期较长的缺点。不同孔径的膜，拦截不同分子量的物质，甜菊素各种糖苷分子量为788～967[3]，理论上采用截留分子量为1000～2000孔径的膜可以达到分离精制的目的。选择膜孔径为3、4、5nm的陶瓷复合膜，在压力0.05～0.15MPa条件下超滤，测定甜菊素的透过率。从表5可以看出，4、5nm的陶瓷复合膜透过率都较好，但5nm的膜滤液颜色仍然很深，主要是水溶性的蛋白和色素等大分子杂质许多未被膜截留，而4nm的膜截留率高许多，因而得到的滤液颜色较浅，除杂效果较好。本工艺选择膜孔径为4nm的陶瓷复合膜。

2.3 柱层析洗脱用乙醇浓度的选择

膜过滤后的提取液中仍然有大量小分子杂质，根据这些小分子杂质的极性不同，用药材质量2.5倍体积的离子交换树脂进行脱盐、脱色。纯化时，将树脂装入层析柱，装柱体积为1.5L，加入提取液，以每小时0.3倍树脂体积（0.3BV/h）的流速经过树脂，然后用水冲洗至无色，再用一定浓度的乙醇溶液以0.3BV/h的流速洗脱，用薄层检测有甜菊素斑点时，开始收集洗脱液，直至TLC检测无甜菊素斑点为止，得到的洗脱液减压浓缩至干，在70℃真空干燥，测得其中甜菊素质量分数。

分别筛选出3种阴离子树脂D941、D330、D318和3种阳离子树脂001×7（732）、D113、D001SD，测定对提取液的脱色特性[12]，结果显示，D001SD、D941具有最佳脱色效果。因此，在本研究中提取液先经过阳离子交换树脂（D001SD），再将洗脱液浓缩后同法经阴离子交换树脂（D941）处理。经实验发现流速越慢，脱色、洗脱效果越好，但考虑到流速过慢会延长生产周期，提高成本，故选用0.3BV/h为脱色、洗脱流速。

一般可采用热水、亲水性有机溶剂作洗脱剂，从洗脱效率、节能、价廉和毒性大小的角度考虑，选取乙醇作洗脱剂较佳。分别用30%、50%、70%（v/v）浓度的乙醇进行洗脱，实验结果如表6所示。

从表6可以看出，用不同浓度乙醇洗脱时，乙醇浓度小，洗脱慢，溶剂消耗较多；乙醇浓度高时，洗脱快，溶剂用量少，但含量偏低，杂质偏多，因此选用50%乙醇较合适。

2.4 醇沉条件选择

表6 不同浓度乙醇洗脱结果Table 6 Effect of ethanol elution

从2.3所得产品含量为70%～80%，并不符合药用辅料的要求，需要进一步精制，根据文献[10]，醇沉即可提高糖苷的含量。将1.8kg药材经提取，膜过滤，离子交换洗脱后的洗脱液平均分成三份，分别将洗脱液浓缩至相对密度1.20（60℃）左右，加入乙醇使含醇量（v/v）分别为75%、80%、85%，搅拌，静置24h，滤过，将沉淀干燥即得。由表7可以看出，含醇量80%（v/v）可得到质量分数大于95.0%的产品。

表7 醇沉浓度的选择Table 7 Effect of the concentration of ethanol precipitation

2.5 喷雾干燥

沉淀直接烘干，易结块，因此生产过程中采用喷雾干燥。将醇沉后所得沉淀用10倍量50%（v/v）的乙醇加热溶解、浓缩，对物料不同的相对密度0.95、1.00、1.05、1.10、1.15；不同进风温度160、170、180、190℃；不同进料流量700～900、900～1100、1100～1300mL/min进行喷雾干燥的单因素实验，测定物料的水分、流动性、堆密度，并进行感观评定物料干燥情况。确定最优喷雾干燥条件为料液相对密度1.05±0.05（60℃），进风温度为（175±5）℃，出风温度为（68±5）℃，进料流量为900～1100mL/min。按所得的干燥条件进行喷雾干燥，收得干燥粉末，测得干燥前后甜菊素质量分数分别为97.2%和96.8%，可见甜菊素含量与喷前基本一致，说明此干燥条件合理可行。

2.6 样品测定

按照上述优选工艺条件，进行了3批中试（每批投料量为20kg）和3批试生产（每批投料量为600kg，分两罐投料），并按1.2.3下产品质量评价方法检验。中试收率分别为6.58%、6.41%、6.22%，质量分数分别为96.8%、97.2%、96.4%；3批试制样品收率分别为6.47%、6.40%、6.32%，质量分数分别为97.0%、96.5%、96.7%，完全符合国家药典标准。三批试制样品与市售的符合药用辅料要求的样品质量比较也基本一致（见表8）。

表8 产品的质量评价Table 8 Evaluation of product quality

对得到的产品进行了红外光谱分析，结果如图5所示。3417.1cm-1为羟基伸缩振动吸收峰，2933.9cm-1、2883.6cm-1为环上碳氢的伸缩振动吸收峰，1740.5～1725.1cm-1、1634.4cm-1为羰基C=0和C=C伸缩振动吸收峰，1170.2、1072.9、1034.3cm-1为碳氧（C-O）伸缩振动吸收峰，是吡喃糖环内酯和羟基的共振吸收峰，是糖类的特征吸收峰，894.8cm-1为碳氢（C-H）伸缩振动吸收峰，为吡喃糖苷键的特征峰。谱图表明，提取产物具有吡喃糖苷的结构特性，且图谱与甜菊苷对照品红外图谱（见图6）一致。

图5 产品的红外光谱Fig.5 IR spectrum of the product

图6 甜菊苷对照品的红外光谱Fig.6 IR spectrum of stevioside reference substance

3 结论

3.1 本文采用90%（v/v）的乙醇回流提取3次，乙醇用量分别为8倍、6倍、5倍药材量，各提取2、1.5、1h；再通过4nm的陶瓷复合膜超滤，以除去大分子杂质。超滤后的滤液再采用阴（D941）、阳离子交换树脂（D001SD）脱色，脱盐以达到提取液纯化的目的，这时的提取液直接干燥，产品色泽符合要求，但质量分数仅70%～80%，不符合药用辅料要求。本文中选择再用80%（v/v）乙醇醇沉，几乎除去了全部的淀粉、多糖、蛋白质、无机盐等杂质，而甜菊素的损失率最小，溶液透明澄清，得到了符合药典要求的甜菊素产品。

3.2 通过本文的研究，确定乙醇提取→膜过滤→树脂纯化→浓缩→醇沉→溶解→喷雾干燥的工艺路线可生产出符合药用辅料要求的甜菊素。连续试制3批，产品质量分数均在95.0%以上，说明该工艺连续生产的稳定性好，工艺条件合理可行，能够满足工业大生产的要求。

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