麦芽中脂肪酶活性检测及酶学性质的研究

康开萍，张盛贵，*，李 红，肖 侠，陈光斌，邵威平

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.中国食品发酵工业研究院，北京100027）

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3），又称三酰基甘油酰基水解酶，是一类特殊的脂键水解酶，能够催化甘油酯类化合物的水解和合成[1]。脂肪酶广泛存在于微生物细胞、动物组织和植物种子中。不同来源的脂肪酶性质有所不同，但其催化机理相似。在啤酒生产过程中，麦芽、大米等原辅料中的脂肪酶将甘油酯和部分糖酯水解成游离脂肪酸[2]，脂肪酸进一步分解产生一些羰基类化合物和醛类物质（如反-2-壬烯醛），降低啤酒的抗氧化能力，从而影响啤酒的口感、风味以及货架期[3-5]。传统的脂肪酶检测方法是以三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯或橄榄油作为底物，通过检测反应释放的脂肪酸或甘油来检测酶活力[6]。而麦芽中脂肪酶活性很低，能够酶解释放的脂肪酸或甘油很微量，另外加之酶解反应通常比较复杂，容易受到多种因素的影响，因此用传统方法很难对麦芽中的脂肪酶活性进行准确测定。本实验以乙酸对硝基苯酚酯为底物，测定了麦芽中脂肪酶的活性，并对其酶学性质进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麦芽 珠江啤酒有限公司；乙酸对硝基苯酚酯（p-NPA）、乙腈、对硝基苯酚 均购于sigma公司；各种金属盐 均为国产分析纯产品。

DLFU-W23050型麦芽粉碎机 Buhler universal公司；HHW21-420型恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂；AG204分析天平 METTLER TOLEDO公司；V3140型分光光度计 GBC公司；磁力搅拌器 VELP Scientific公司；MEDIFRIGER-BL型冷冻离心机 J.P.SELECTA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绘制对硝基苯酚标准曲线 配制0.0025～0.0325mmol/L的对硝基苯酚溶液，在波长405nm处比色。得到对硝基苯酚浓度与吸光度的标准曲线方程：Y=16.879X+0.0009（X：浓度，mmol/L；Y：吸光度；R2=1），通过标准曲线方程计算脂肪酶活力。

1.2.2 麦芽脂肪酶提取液制备 麦芽粉碎后称取2g置于150mL三角瓶中，加入20mL 0.1mol/L pH5.0的磷酸钾缓冲液，在磁力搅拌器上600r/min搅拌提取30min后转入离心管中，3000r/min离心15min，上清液作为实验用酶液。

图1 对硝基苯酚标准曲线Fig.1 Standard curver of p-NPA

1.2.3 脂肪酶活性测定 参照文献[7-9]的方法，稍做修改。以3mL最适pH的磷酸缓冲液作为反应介质，加入350μL 5mmol/L的p-NPA溶液和50μL脂肪酶提取液，充分混合，在波长405nm处比色。记录10min内的吸光度变化值。以100g麦芽中的脂肪酶1min内水解乙酸对硝基苯酚酯生成对硝基苯酚的μmol数定义为一个酶活单位。

式中：U：酶活力，μmol/min；X：对硝基苯酚浓度（由标准曲线获得），mmol/L；V2：反应体系总体积，mL；V0：提取液的体积，mL；Δt：反应时间，min；V1：参与反应的酶液体积，mL；W：样品的重量，g。

1.2.4 反应pH对酶活性的影响 取50μL的脂肪酶提取液，使其在3mL，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的缓冲体系中，室温条件下与p-NPA反应，用比色法测定pH对酶活的影响。以绝对酶活为纵坐标，反应pH为横坐标，绘制酶活曲线。

1.2.5 底物添加量对酶活性的影响 取50μL的脂肪酶提取液，使其在最适pH缓冲液中，室温条件下与浓度为5mmol/L不同添加量的p-NPA溶液反应，用比色法测定底物浓度对酶活的影响。以绝对酶活为纵坐标，底物浓度为横坐标，绘制酶活曲线。

1.2.6 脂肪酶的温度稳定性 将脂肪酶提取液分别放置在30、40、50、60、70℃的水浴内保温，每隔20min在室温、最适反应pH以及最适底物添加量的条件下，用比色法测定脂肪酶提取液的残余酶活。以绝对酶活为纵坐标，反应时间为横坐标，绘制酶活曲线。

1.2.7 金属离子对酶活性的影响 在脂肪酶检测体系中加入50μL，10mmol/L的金属离子溶液（Fe3+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Na+、K+、Mg2+、Zn2+），在室温，最适反应pH，最适底物添加量的条件下用比色法测酶活，绘制相对酶活曲线（未经处理的酶液活力为100%），比较各种金属离子对酶活的影响。

1.2.8 脂肪酶动力学常数的测定 取50μL脂肪酶提取液，使其在3mL最适pH的缓冲液中与最适添加量的底物反应，用分光光度计于波长405nm处时间扫描2h内的吸光度值，确定酶反应的初速度时间范围；测定酶与不同浓度底物的反应初速度，然后以底物浓度的倒数（1/[S]）为横坐标、反应初速度的倒数（1/V）为纵坐标，用Lineweaver Burk双倒数作图，经线性拟合得回归直线，从而计算出麦芽中脂肪酶对底物p-NPA的Km和Vm。

2 结果与讨论

2.1 反应pH对酶活性的影响

酶催化反应的特点之一是对反应体系的pH非常敏感，这是因为pH改变了酶活性部位有关基团的离解状态（酶分子上有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团），或者影响了酶的空间结构，从而改变了酶的活性[10]。在最适pH时，酶分子上活性基团的离解状态最适于酶与底物结合。麦芽中脂肪酶活力受pH的影响如图2所示，在一定pH范围内，随pH的升高，麦芽中脂肪酶的活力逐渐增加。pH在6～8.5的范围内，脂肪酶活力有显著性差异（p＜0.05）；当pH8～8.5时，该酶有较高活力；pH大于8.5时酶活力迅速下降，所以酶反应的最适pH为8.5。这与顾美英[11]报道的微生物脂肪酶最适pH7.0～9.0相似，与粟慧君等[12]研究的猪胰脂肪酶的最适pH为8.5相同。

图2 pH对酶活力的影响Fig.2 pH value on the influence of enzyme activity

2.2 底物添加量对酶活性的影响

如图3所示，在一定底物添加量范围内，麦芽中脂肪酶的活力随着底物添加量的增加而增大，底物添加量在50～250μL范围内，脂肪酶活力差异显著（p＜0.05）；p-NPA对脂肪酶有过量底物抑制现象，当底物添加量大于350μL时，酶活力又呈略微下降趋势；因此最适底物添加量为350μL，此时反应体系中底物浓度约为0.52mmol/L。

图3 不同底物用量对酶活的影响Fig.3 Different zymolyte content on the influence of enzyme

2.3 脂肪酶的热稳定性

如图4所示，麦芽中脂肪酶的热稳定性较高，30℃水浴保温40min酶活力增加5%，120min酶活力几乎保持不变；40℃水浴保温120min酶活力仅下降5%；60℃水浴保温120min后，酶活力残余32.5%；70℃水浴酶活力很快下降，120min后酶几乎失活。这与吴尧等[13]报道的白地霉脂肪酶40℃保存很快失活以及陈贵元等[14]报道的真菌脂肪酶在37℃保温60min酶活下降近50%有较大差异，相比之下麦芽脂肪酶具有更高的热稳定性。

图4 脂肪酶的热稳定性Fig.4 Thermal stability of Lipase

2.4 属离子对酶活性的影响

金属离子促进或抑制酶反应的机理是多种多样的。某些金属离子可以作为脂肪酶的激活剂或者辅助因子。金属离子作为激活剂可能与脂肪酶活性部位以外的部位结合，通过酶蛋白构型的某种变化，使得脂肪酶的活性部位更适宜与底物结合，并催化底物反应；金属离子作为辅助因子时涉及到它与脂肪酶活性部位的功能基团和底物反应基团的结合，从而起到不可缺少的桥梁作用或催化作用[15]。

从图5可以看出，Fe3+、K+对麦芽脂肪酶均有一定的激活作用；Cu2+、Mg2+、Zn2+均有不同程度的的抑制作用，其中Mg2+的抑制作用较为显著；Ca2+、Mn2+、Na+对脂肪酶活力没有显著影响，这与陆界瑾[16]报道的Mg2+对细菌脂肪酶有明显激活作用以及邹文欣等[17]报道的Ca2+、Mn2+对液化沙雷氏菌脂肪酶有一定激活作用，Mg2+、K+对酶活性的影响不大，Fe2+、Fe3+抑制酶活的实验结果均有差异。可以看出同一种金属离子对不同来源的脂肪酶催化效果有明显差异，这也可能与金属离子浓度有关。

图5 金属离子对酶活性的影响Fig.5 Metal ion on the influence of enzyme

2.5 麦芽脂肪酶动力学常数的测定

由图6可以看出，酶促反应在50min以内，吸光度呈直线增加，反应速率保持不变，即50min以内均为初速度范围。因此在测定麦芽脂肪酶动力学常数时，可选择反应时间为10min，以便计算酶活。

图6 反应时间与吸光度的关系Fig.6 The relationship of reaction time and absorbance

以3mL，pH8.5的磷酸缓冲液作为反应介质将50μL脂肪酶提取液分别与50μL，5～30mmol/L的p-NPA反应10min，测得脂肪酶与不同浓度底物的反应初速度V；再以反应初速度的倒数1/V为纵坐标，以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标进行双倒数作图，所得直线在横坐标轴上的截距为-1/Km，在纵坐标轴上的截距为1/Vm。从图7的直线方程可以计算出，麦芽脂肪酶对p-NPA的Km为0.13mmol/L，Vm为0.016mg/min。对于大多数酶，一般认为测定酶活性时底物浓度最好为Km的20～100倍，但本次实验中考虑到底物p-NPA的溶解情况以及p-NPA对脂肪酶具有底物过量抑制现象，当反应体系中底物浓度达到6倍Km时，酶反应速率呈下降趋势，因此选择最大反应速率时的底物浓度为最适底物浓度，此时底物浓度变化对反应速率影响最小，故误差最小。

图7 麦芽脂肪酶的Lineweaver-Burk图（p-NPA）Fig.7 Lineweaver-Burk mapping of Barley malt lipase

3 结论

麦芽中脂肪酶的最适pH为8.5，属于弱碱性脂肪酶；5mmol/L的p-NPA对50μL脂肪酶提取液的最适反应添加量为350μL，即最适反应体积比为1∶7。

麦芽中脂肪酶的热稳定性较高，40℃水浴保温120min后酶活几乎保持不变，70℃水浴保温120min后几乎接近失活。

金属离子Ca2+、Mn2+、Na+对麦芽脂肪酶活性无显著影响，Cu2+、Mg2+、Zn2+对麦芽脂肪酶活性有不同程度的抑制作用，其中Mg2+有较显著的抑制作用，而Fe3+、K+对脂肪酶活性有不同程度的激活作用。

采用Lineweaver Burk双倒数作图法测定麦芽脂肪酶的酶动力学常数：麦芽脂肪酶对p-NPA的Km值为0.13mmol/L，Vm值为0.016mg/min。

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