酶解条件对花生粕水解液的抗氧化活性影响研究

陈盛楠，江连洲，2，*，李 扬，2，*，乔国华，刘 珊

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150030；3.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，草业饲料研究室，甘肃兰州730050）

花生蛋白是一种营养价值较高的植物蛋白资源，其营养价值与动物蛋白相近。花生经脱脂后，其蛋白质含量（浸出法）达55%，采用水溶法脱脂的蛋白质含量可达70%以上，且不含胆固醇，花生中含有的优质蛋白质，可消化性高，其有效利用率可达98%，并且几乎包括人体必需的8种氨基酸[1]。花生粕作为压榨花生油的一种副产物，产量大，来源广，价格低，且其中含有30%～50%的花生蛋白质，花生抗氧化活性水解物中含有人体所必需的8种氨基酸，尤其是硫氨酸的含量相当高，总氮量高达14.8%，水解液中的抗氧化物使体内的过氧化氢和过氧化脂质还原，防止体内生成过氧化脂质，具有保护生物膜、守卫生物体的作用；可清除自由基，延缓衰老，具有良好的抗氧化性[2]。碱性蛋白酶（内肽酶）酶解花生粕主要产生低分子量蛋白和肽，可以提高蛋白质的功能特性，产生的肽具有易消化吸收和一些蛋白质无法比拟的物理化学特性，如良好的起泡性、乳化性及抗氧化活性，某些小分子的肽甚至具有特殊的生理活性[3-4]。因此，本实验通过研究不同酶解条件来提高花生粕水解液的抗氧化性，为生产花生抗氧化物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

低温花生粕 水分6.47%，蛋白质53.89%，脂肪20.16%，水溶性膳食纤维1.19%，非水溶性膳食纤维4.51%，灰分5.78%，青岛亮泉植物油有限公司；Alcalase碱性蛋白酶（活力1.2×105U/mL） Novo公司；乙醚、盐酸、NaOH、H2SO4、FeCl3、EDTA、H2O2、VC等 均为分析纯。

FA2004电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；F2102植物试样粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；pHS-3C酸度计 上海雷磁仪器厂；DZKWS-4电热恒温水浴箱 北京市用光明医疗器械厂；DU800紫外分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 常规指标测定方法 水分的测定：依据GB 5009.3-2010；粗脂肪的测定：依据GB/T 14772-2008；粗蛋白的测定：依据GB 5009.5-2010；膳食纤维的测定：依据GB/T 5009.88-2008；灰分测定：依据GB/T 5505-2008；TCA-NSI测定：依据三氯乙酸（TCA）可溶性氮法（NSI）法。

1.2.2 工艺流程

1.2.3 羟基自由基（·OH）清除能力的测定 采用D-脱氧核糖-Fe体系法[5-6]。吸取0.1mL 5%的酶解物溶液，移入试管中，加0.1mL 1.04mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、0.1mL 1mmol/L FeCl3溶液、0.1mL 2mmol/L VC溶液、0.1mL 10mmol/L H2O2溶液、0.1mL 60mmol/L脱氧核糖（DR）溶液和0.4mL pH7.5 KH2PO4-NaOH缓冲溶液。37℃水浴1h，加1mL 25%HCl溶液终止反应，加1mL 1%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，100℃水浴15min，冷却后有沉淀，加入1mL正丁醇萃取颜色，然后于532nm波长处测定吸光值。以空白作参比，按式（1）计算。

式中：A0-不加样品的空白吸光度；A1-加入样品和2-脱氧-D-核糖的吸光度；A2-样品在体系中吸光度（不加DR）。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 加酶量对羟基自由基清除能力的影响 底物浓度为10%，酶解时间为4h，酶解温度为45℃，酶解pH为8.0，加酶量分别是6000、8000、10000、12000、14000U/g底物。

1.2.4.2 底物浓度对羟基自由基清除能力的影响 加酶量为12000U/g底物，酶解时间为4h，酶解温度为45℃，酶解pH为8.0，底物浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%。

1.2.4.3 酶解时间对羟基自由基清除能力的影响 底物浓度为8%，酶解温度为45℃，酶解pH为8.0，加酶量为12000U/g底物，酶解时间分别为2、3、4、5、6h。

1.2.4.4 酶解温度对羟基自由基清除能力的影响 底物浓度为8%，酶解时间为4h，酶解pH为8.0，加酶量为

12000U/g底物，酶解温度分别为35、40、45、50、55℃。

1.2.4.5 酶解pH对羟基自由基清除能力的影响 底物浓度为8%，酶解时间为4h，加酶量为12000U/g底物，酶解温度为45℃，酶解pH分别为7、7.5、8、8.5、9。

在单因素研究的基础上，选取加酶量、底物浓度、酶解温度、酶解时间、酶解pH 5个因素为自变量，以羟基自由基清除能力为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析实验。对实验结果数据采用Design-Expert 8.0.5软件进行分析，其因素水平编码表见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Response surface experimental factors and levels

2 结果与讨论

2.1 酶解条件对羟基自由基清除能力的单因素实验

2.2.1 加酶量对羟基自由基清除能力的影响 加酶量对花生粕水解液羟基自由基清除能力的影响如图1所示。由图1可见，随着加酶量的增加，酶解反应的速度加快，但速度增加的幅度逐渐降低。在实际操作中，加酶量太大，会增加成本，因此从节约的角度出发，选择加酶量在11000～13000U/g底物进行研究。

图1 加酶量对羟基自由基清除能力的影响Fig.1 Effect of the enzyme dosage on the hydroxyl radical scavenging capacity

2.2.2 底物浓度对羟基自由基清除能力的影响 由图2可知，羟基自由基清除能力随着底物浓度的升高，先上升后下降，在8%时达到最高值。这主要是因为在低浓度时，溶质流动性好，但酶的浓度低，反应进行的比较慢，在高浓度时，溶质流动性差，酶与底物的接触不充分，限制了反应的进行[7]，因此水解程度低，抗氧化性降低。本实验选取底物浓度为6%～10%进行酶解反应条件的研究。

图2 底物浓度对羟基自由基清除能力的影响Fig.2 Effect of the substrate concentration on the hydroxyl radical scavenging capacity

2.2.3 酶解时间对羟基自由基清除能力的影响 反应时间对花生粕水解液羟基自由基清除能力的影响见图3。从羟基自由基清除的过程看，碱性蛋白酶水解花生粕符合一般的酶解曲线。前期4h内，对羟基自由基清除能力变化最快，主要是因为刚开始反应酶的活性最高，反应速度最快；随着时间的延长，可参加反应的酶量减少，活性下降，以及酶解产物的抑制作用，反应速度放缓直至蛋白酶完全失活，至5h时反应几乎停顿，表现为水解度不再增加[8]，考虑实际情况，酶水解花生粕的时间在3～5h较优。

图3 酶解时间对羟基自由基清除能力的影响Fig.3 Effect of the enzyme time on the hydroxyl radical scavenging capacity

图4 酶解温度对羟基自由基清除能力的影响Fig.4 Effect of the temperature on the hydroxyl radical scavenging capacity

2.2.4 酶解温度对羟基自由基清除能力的影响 酶解温度对羟基自由基清除能力的影响如图4所示，随着温度的升高，羟基自由基清除能力先增大后减小，在45℃时达到最大值。这是因为酶对温度十分敏感，当温度过高时会变性失活，温度过低不是酶的最佳反应温度，因此45℃时羟基自由基清除能力有最大值。

图5 酶解pH对羟基自由基清除能力的影响Fig.5 EffectofthepH onthehydroxylradicalscavengingcapacity

表2 响应面设计方案和实验结果Table 2 Results of the response surface design scheme and experimental

2.2.5 酶解pH对羟基自由基清除能力的影响 酶解pH对羟基自由基清除能力的影响如图5所示，随着pH的增加，羟基自由基清除能力逐渐上升，pH8.5时，羟基自由基清除能力达到最大，而后下降。在pH低于8.5之前，随着pH升高，pH偏离大豆蛋白的等电点，因而溶解性提高，水解程度高，利于提高水解液的抗氧化性。但pH过高，超过了酶的最适作用范围，酶会变性失活，水解不充分，降低水解液的抗氧化性。此外，过高的pH会使蛋白质形成有毒聚合物[2]。

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面设计方案和实验结果 在单因素研究的基础上，选取加酶量、底物浓度、酶解温度、酶解时间、酶解pH 5个因素为自变量，以羟基自由基清除能力为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析实验，响应面实验方案及结果见表2。

利用Design-Expert 8.0.5软件对实验结果进行二次回归分析，计算羟基自由基清除能力Y的回归方程，并进行方差分析（见表3）。羟基自由基清除能力Y的标准回归方程为：

对羟基自由基清除能力的实验数据进行方差分析并进行显著性检验，结果如表3所示。

由表3的方差分析结果可以看出，所得回归方程极显著（p＜0.01），且模型失拟检验不显著，这说明用模型方程Y与实际情况拟合较好，能够拟合真实响应面，反映出羟基自由基清除能力与加酶量、底物浓度、酶解温度、酶解时间及酶解pH之间的关系。模型决定系数R2=0.9864（R2＞0.8000），说明有98.64%的变化能通过这个模型解释，实验误差较小，模型成立，可以通过此模型对花生粕水解液的羟基自由基清除能力进行预测和分析。

由表3中的各项系数的显著性检验可知，一次项A、C、D、E，交互项AE、BC、CD、二次项A2、B2、C2、D2、E2对羟基自由基清除能力有显著的影响（p＜0.05），其中A、C、D、E、CD、A2、B2、C2、D2、E2羟基自由基清除能力有极显著的影响（p＜0.01），其他因素影响不显著（p＞0.05），这表明羟基自由基清除能力的变化相当复杂，各种影响因素对羟基自由基清除能力的影响不是简单的线性关系，而是呈二次关系，且各因素之间存在交互作用。将差异不显著的各项去除后可以得到简化的回归方程模型为：

表3 羟基自由基清除能力的实验结果方差分析表Table 3 Analysis of hydroxyl radical scavenging ability of the experiment results

对回归方程进行中心标准化处理，从回归方程Y一次项回归系数的绝对值大小来判断5个因素对多肽提取率的影响程度。一次项回归系数的绝对值大小依次为D＞E＞A＞C＞B，表明5个因素对多肽提取率的影响顺序为：酶解时间＞酶解pH＞加酶量＞酶解温度＞底物浓度。

2.3 最佳条件确定及验证实验

应用响应面优化分析方法对回归模型进行分析，可知当加酶量为11820U/g，底物浓度为7.52%，酶解温度为43.1℃，酶解时间为3.9h，酶解pH为8.47，响应面有最优值，羟基自由基清除能力为60.54%。

采用上述优化后的工艺条件，即当加酶量为12000U/g，底物浓度为7.5%，酶解温度为43℃，酶解时间为4h，酶解pH为8.5，进行验证实验，测得羟基自由基清除能力为60.21%（平行三次）。这与理论预测值误差在1%以内，说明采用响应面法优化得到的工艺条件参数准确可靠，按照建立的模型进行预测在实践中是可行的。

3 结论

通过单因素和响应面实验研究酶解条件对花生粕水解液的抗氧化性的影响，得到影响羟基自由基清除能力效果的因素为酶解时间＞酶解pH＞加酶量＞酶解温度＞底物浓度。最优羟基自由基清除能力参数为：加酶量为11820U/g，底物浓度为7.52%，酶解温度为43.1℃，酶解时间为3.9h，酶解pH为8.47，响应面有最优值，羟基自由基清除能力为60.54%，在上述优化后的工艺条件下的验证实验测得羟基自由基清除能力为60.21%。随着花生肽生产规模的扩大，其价格将逐步降低，它作为一种新的原料，必将在食品、药品乃至化妆品等诸多领域展示出更加广阔的开发应用前景。

[1]刘阳，邢福国.花生蛋白的开发和利用现状[J].食品科技，2008，33（12）：173-176.

[2]王建化，熊柳，孙高飞，等.花生抗氧化活性肽制取工艺的研究[J].中国油脂，2008，33（6）：15-18.

[3]陈庆华.花生蛋白酶解特性研究[J].江苏农业科学，2009（3）：320-322.

[4]吴肖，刘通讯，林勉.复合酶水解花生粕蛋白工艺研究[J].食品工业科技，2005，26（1）：120-121.

[5]黄文，谢笔钧，王益，等.白果蛋白质的分离、纯化、理化特性及其抗氧化活性研究[J].中国农业科学，2004，37（10）：1537-1543.

[6]Shu YaoTsai，Shih Jeng Huang，Jeng Leun Mau.Antioxidant properties of hot water extracts from Agrocybe cylindracea[J].Food Chemistry，2006，98（6）：670-677.

[7]仪凯，周瑞宝.中性蛋白酶水解花生粕的研究[J].中国油脂，2005，30（7）：71-73.

[8]王镜岩，朱圣庚，徐长发.生物化学：上册[M].第3版.北京：高等教育出版社，2002：123-126.