Meso-四-（3，5-二溴-4-羟基苯）卟啉分光光度法测定虾中铅的含量

何 平，钟耀广，万金庆

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

虾中含有丰富的营养素，其肌纤维细嫩，易于消化吸收[1]。目前，我国虾产品贸易在国际水产品市场上占据着重要地位，然而，世界性的工业“三废”的无序排放，使得虾中铅污染等问题日益严重[2]。铅可以通过食物链在生物组织中富集，最终被人体吸收，对人体各个系统造成危害[3]。目前，有关铅浓度的检测方法报道较多，常用的有火焰原子吸收光谱法、石墨炉原子吸收光谱法、氢化物-原子荧光光谱法等[4]，但这些方法所用的仪器昂贵，成本高，而分光光度法成本相对低，操作也简单。测铅的显色剂Meso-四-（3，5-二溴-4-羟基苯）卟啉（T（DBHP）P）被称为“超高灵敏显色剂”，常被用在水中铅的快速检测中[5]。它具有四个吡咯环，中间的四个氮原子形成严密的配位环境，所以特定的金属离子才能与之形成稳定的配合物[6]。它是非水溶性卟啉，在N，N’-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中比较稳定[7]。但是显色反应条件为强碱性，此条件下，样品中的钙镁等离子会生成沉淀，干扰检测结果，而且受分光光度计本身的检测限限制，无法满足国标中对虾中铅最低限的要求（0.5mg/kg）。本实验采用的沉淀法[8]不仅对待测样液进行了富集，克服了仪器及显色剂检测限的局限，同时避免了钙镁等离子对检测结果的干扰，并使操作更加简单易操作，同时节约了成本。通过研究T（DBHP）P与铅的显色反应条件，测定虾中铅的含量，为T（DBHP）P在食品中铅检测的应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海虾 购于上海市芦潮港果园集贸市场；铅标准溶液（1mg/mL） 国药上海化学试剂公司；Meso-四-（3，5-二溴-4-羟基苯）卟啉 上海金圣化工有限公司；曲拉通X-100（OP）（化学纯） 国药上海化学试剂公司。

UV2300双光束紫外可见分光光度计（波长范围190.0～1100.0nm） 上海天美科学仪器有限公司；PHS-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 配合物最大波长的选择 将配好的0.016%T（DBHP）P溶液稀释50倍，以水做参比调零，在370～530nm进行光谱扫描。

吸取4.00mL 1μg/mL的铅标准溶液于10mL的比色管中，加入1.00mL 0.3mol/L氢氧化钠，1.00mL T（DBHP）P，混匀后放入沸水浴中加热5min，冷却至室温，加入1.00mL 5%OP，用水定容，以试剂空白为0.016%参比，在460～500nm进行光谱扫描[8]。

1.2.2 选择配合物产生的最佳条件

1.2.2.1 T（DBHP）P用量选择 在6只比色管中依次各加入4.00mL 1μg/mL铅标准溶液，1.00mL 0.3mol/L氢氧化钠溶液，0.50、0.80、1.30、1.50、1.80、2.00mL 0.016%T（DBHP）P，混匀后放入沸水浴中加热5min，冷却后加入1.00mL 5%OP，用水定容至10.00mL，以试剂空白为参比，在分光光度计上测得其在479nm处的吸光值。

1.2.2.2 氢氧化钠用量的选择 吸取4.00mL 1μg/mL铅标准溶液于8支比色管中，分别加入1.30mL 0.016%T（DBHP）P，分别再加入0.3mol/L氢氧化钠溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，混匀后放入沸水浴中加热5min，冷却至室温，加入1.00mL 5%OP，用去离子水定容，以试剂空白为参比，在分光光度计上测得其在479nm处的吸光值。

1.2.2.3 增敏剂用量的选择 吸取4.00mL 1μg/mL铅标准溶液于8支比色管中，各加入1.30mL 0.016%T（DBHP）P，0.40mL 0.3mol/L氢氧化钠溶液，混匀后放入沸水浴中加热5min，冷却后分别加入0.00、0.20、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、1.00mL 5%OP，用去离子水定容，以试剂空白为参比，在分光光度计上测得其在479nm处的吸光值。

1.2.2.4 温度的选择 吸取4.00mL 1μg/mL铅标准溶液于6支比色管中，各加入0.016%T（DBHP）P 1.30mL，0.3mol/L氢氧化钠溶液0.40mL，混匀后放入水浴锅中加热5min，温度分别设定为25、40、55、70、85、100℃，冷却后加入0.70mL 5%OP，用去离子水定容，以试剂空白为参比，在分光光度计上测得其在479nm处的吸光值。

1.2.2.5 时间的影响 吸取4.00mL 1μg/mL铅标准溶液于5支比色管中，分别加入1.30mL 0.016%T（DBHP）P，氢氧化钠溶液（0.3mol/L）0.4mL，混匀后放入沸水浴中加热，加热时间分别设定为1、2、3、4、5min，冷却后加入0.70mL 5%OP，用去离子水定容，以试剂空白为参比，在分光光度计上测得其在479nm处的吸光值。

1.2.3 样品检测

1.2.3.1 标准曲线的绘制 移取浓度为10.0μg/mL铅标准液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00mL于10个10mL容量瓶中，用去离子水定容分别得到浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00μg/mL铅标准溶液。分别取上述铅标准溶液4mL于10mL的比色管中，然后依次加入1.30mL显色剂，0.40mL 0.3mol/L氢氧化钠，将比色管放入沸水浴中加热3min，放冷水中冷却至室温，加0.70mL 5%OP，用去离子水定容，以试剂空白作参比，479nm处测其吸光值，作吸光度值对铅浓度的标准曲线，求出直线回归方程。

1.2.3.2 检出限及检测重现性 移取1.0μg/mL的铅标准液4.00mL于10mL的比色管中，然后依次加入1.30mL显色剂，0.40mL 0.3mol/L氢氧化钠，将比色管放入沸水浴中加热3min，放冷水中冷却至室温，加0.70mL 5%OP，最后用去离子水定容，用试剂空白调零，479nm处测其吸光值，上述操作重复11次。

1.2.3.3 样品分析

1.2.3.3.1 样品消化 取虾肉用匀浆机打成匀浆，准确称取5.00g左右，放入瓷坩埚中，先在电炉上炭化至无烟，灰化后，用浓硝酸将灰分溶解，加热至消化完全，然后冷却至室温[9]，用氢氧化钠溶液调节pH至3～5，移入50mL的容量瓶中，用去离子水定容，制成样液a。

1.2.3.3.2 铅的富集与分离 分别移取样液a 10.00mL置于3只25mL的比色管中，各加入1.20mL 0.3moL/L Na2CO3，然后分别移入1、2、3号离心管，5000r/min离心3min，弃上清液；在1号离心管加入2mL氢氧化钠（0.3mol/L），混匀，5000r/min离心3min；取上清液倒入2号离心管，混匀，5000r/min离心3min；取上清液倒入3号离心管，混匀，5000r/min离心3min，取上清液移入10mL比色管中，此操作重复3次，比色管中的上清液用去离子水定容，制成待测样液b。

1.2.3.3.3 样品的测定 移取待测样液b 4.00mL置于比色管中，然后依次加入1.30mL显色剂，将比色管放入沸水浴中加热3min，放冷水中冷却至室温，加0.70mL 5%OP，最后用去离子水定容，用试剂空白调零，在479nm处测定其吸光值，上述操作重复3次。

1.2.3.3.4 回收率实验 取3支10mL比色管，各加入样品溶液b 6mL，依次加入1.30mL显色剂，将比色管放入沸水浴中加热3min，在冷水中冷却至室温，加入0.7mL 5%OP，用去离子水定容，试剂空白调零，在479nm处测定其吸光值。

另取3支10mL比色管，各加入样品溶液b 6mL，然后分别在各比色管中加入0.50、1.00、1.50mL 1μg/mL铅标准液，再分别加入1.30mL显色剂，将比色管放入沸水浴中，加热3min，冷却至室温，加0.70mL 5%OP，去离子水定容，用试剂空白调零，在479nm处测定其吸光值。

2 结果与分析

2.1 配合物最大波长的选择结果与分析

图1 显色剂和配合物的光谱扫描图Fig.1 Ultraviolet-visible spectrum of T（DBHP）P and the complex

比较图1中的系列1和系列2，显色剂在380nm处有最大吸收峰，而生成的配合物的吸收峰在479nm处，且Δλ=99nm，显色剂对配合物的干扰可忽略[10]，因此本实验所有样品的吸光值均在479nm处测定。

2.2 各单因素对生成配合物的影响

2.2.1 T（DBHP）P用量的影响 如图2所示，当0.016%T（DBHP）P的加入量小于1.3mL时，T（DBHP）P加入量对吸光度的影响显著（p＜0.05）；当0.016%T（DBHP）P加入量在1.3～2.0mL之间时，生成的配合物吸光度没有明显差异。据文献[11]报道，当加入量大于2mL时，试剂空白的吸光度过大，会降低反应的灵敏度。所以选择显色剂的用量为1.3mL。

图2 T（DBHP）P用量对配合物的影响Fig.2 The effect of T（DBHP）P amount of the complex

2.2.2 酸度的影响 图3实验结果表明，0.3mol/L NaOH的加入量小于0.40mL时，随着NaOH加入量的增加，吸光度在逐渐增大，NaOH加入量对吸光度值影响显著（p＜0.05），NaOH的加入量大于0.4mL时，生成的配合物吸光度保持基本稳定。所以在本实验条件下，氢氧化钠的用量选择0.40mL较为合适，此时配合物生成量达到较大值，氢氧化钠的量继续增大，生成配合物的量保持稳定。

2.2.3 增敏剂用量的影响 如图4所示，5%OP对于T（DBHP）P与Pb的显色反应有较大的增敏作用，OP加入量小于0.7mL时对吸光度值的影响显著（p＜0.05），当OP的加入量在0.7～1.0mL时，生成的的配合物吸光度值保持稳定，所以选择OP的加入量为0.7mL。

2.2.4 温度对反应的影响 对图5进行分析，温度对生成配合物的吸光度值的影响显著（p＜0.05），随着温度的升高，吸光值越来越大。当100℃时吸光度值达到最大，说明生成的配合物量最大，反应最彻底，所以反应最佳温度为100℃。

图3 NaOH用量对配合物的影响Fig.3 The effect of NaOH amount of the complex

图4 OP用量对配合物的影响Fig.4 The effect of OP amount of the complex

图5 温度对配合物的影响Fig.5 The effect of temperature of the complex

2.2.5 时间的影响 由图6可知，在1～3min范围内，随着时间延长，吸光度值在增大，生成的配合物在增多，时间对吸光度值的影响显著（p＜0.05），3min以后趋于平缓，所以反应时间选择3min最为理想。

2.3 样品的检验结果

2.3.1 标准曲线 以铅离子浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，如图7所示，建立标准曲线，在0.1～1.0mg/L范围内，铅离子浓度与吸光度有良好的线性关系，符合比尔定律[12]，回归方程：y=0.9237+0.0115，R=0.9995，计算得ε=1.528×108L/（mol·cm）。

2.3.2 检出限及检测重现性 对1.0μg/mL Pb标准液进行了11组平行测定，由表1可见，此方法对铅的检测限为0.035μg/L，RSD平均值为1.2%，小于5%，表明本法具有良好的精密度。

2.3.3 样品分析

2.3.3.1 样品的测定 在上述实验的基础上，对海虾中铅含量进行了检测，结果见表2，海虾中铅的含量为0.068mg/kg，而国标对虾中铅的规定限量为0.5mg/kg，证明购于上海市芦潮港果园集贸市场的海虾中的铅含量没有超出国家标准。

表1 重现性实验结果表Table 1 Repeatability analysis

图6 时间的影响Fig.6 The effect of time

图8 标准曲线Fig.8 Calibration curve

表2 样品中铅的测定值Table 2 Results of Pb in sample analysis

2.3.3.2 回收率实验结果与分析 为考察方法的可靠性，进行了回收率实验，实验测定了3组样品，每组测定3次，由表3可见，得到的回收率在95%～97%，证明方法的准确度可以满足分析样品的要求。

表3 回收率实验结果表Table 3 Recovery of method

3 结论

本研究所得的T（DBHP）P与Pb生成配合物的最佳参数为：在本实验条件下，0.3mol/L NaOH的用量为0.40mL，沸水浴加热时间为3min，5%OP对T（DBHP）P与Pb的显色反应有较大的增敏作用。当铅含量在0.1～1.0μg/mL时，标准曲线符合比尔定律，回归方程为：y=0.9237+0.0115，R=0.9995，ε=1.528×108L/（mol·cm）。

与张跃华等[13]采用的分光光度法相比，本实验采用了沉淀富集法与分光光度法结合，对铅进行了富集，避免了在碱性环境中，钙镁等离子生成沉淀，从而干扰检测结果。本实验用水浴加热的方法代替添加催化剂8-羟基喹啉，这样既节省了成本，而且避免了8-羟基喹啉与样液中钙镁等离子结合而影响实验结果。

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