虫害马尾松挥发性化学物质变化规律及其诱导邻近马尾松抗性的初步研究

2013-05-16王丽霞徐志宏陈为民孙品雷巫冬江俞春来包春泉

浙江林业科技 2013年6期

王丽霞，徐志宏*，陈为民，孙品雷，巫冬江，俞春来，包春泉

（1. 浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安 311300；2. 杭州市森林和野生动物保护管理总站，浙江杭州 310009；3. 浙江省淳安县森林病虫害防治检疫站，浙江淳安 311700；4. 浙江省桐庐县森林病虫防治站，浙江桐庐 311500）

王丽霞1，徐志宏1*，陈为民2，孙品雷2，巫冬江2，俞春来3，包春泉4

采用HS/SPME-GC/MS分析了马尾松虫害植株与健康株主干树皮挥发性物质的成分及其含量，对虫害和健康马尾松主干树皮挥发性物质的变化规律进行对比研究。结果表明：虫害马尾松主干树皮挥发物的主要成分是萜烯类化合物，分别是 α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、石竹烯等，其次是十一烷和十二烷；与对照相比，虫害马尾松植株主干树皮挥发性物质的种类和含量明显低于对照，证明马尾松受到虫害后，体内的防御系统被破坏，马尾松树体抗性明显下降；同时虫害附近的健康株主干树皮挥发性物质的种类和含量明显高于对照，证明马尾松受到虫害后，可以诱导邻近马尾松树体启动了体内的防御系统，从而使其产生抗性。

马尾松；邻近植株；挥发性化学物质；变化规律

植食性昆虫诱导的植物挥发物可以抵御昆虫侵害或者吸引它们的天敌，也可以诱导邻近植物产生防御反应[1～2]，已有的研究表明：当豆科植物叶片受到螨虫危害后，受伤害的叶片将释放挥发性物质促成了植物间的相互感应，这种由植物向高层营养级所发出的介质信号被称为“求救信号”[3]。David C Degenhardt等[4]研究证明食草动物伤害后以及应用茉莉酸后的西红柿可以诱导产生挥发性物质；Arimura G[5]研究还认为已虫害的豆科植物散发的挥发性物质触发了邻近植物叶片中编码与发病机理相关的蛋白质和苯基丙氨酸氨裂解酶基因的转录，这个发现表明未受损伤的豆科植物可能是对挥发性物质信号的应答。马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus）是我国南方造林树种马尾松（Pinus massoniana）的优势害虫，具有周期性暴发的规律[6]。胡永建等[7]用TCT-GC/MS分析了马尾松、湿地松挥发性有机化合物的昼夜节律变化，结果表明：马尾松昼夜节律中检测到的挥发物主要是萜烯类化合物，其中单萜种类最多，且α-蒎烯和β-蒎烯含量约占整个挥发物的 80%，其次是含氧化合物等。任琴等[8]分别对野外及盆栽虫害马尾松针叶挥发物的时序变化进行了研究，研究结果表明：受害针叶萜烯类化合物多数在1 h后升高。胡永建等[9]用GC/MS分析了邻枝针叶不同时间序列中茉莉酸甲酯的含量，结果表明虫害马尾松邻枝针叶1 h茉莉酸甲酯含量就有所升高，2 h显著高于对照（为对照的近1倍），证明马尾松受到虫害后，启动了体内的防御系统，并诱导邻枝产生抗性。茉莉酸甲酯被认为是受伤害植物诱导防御基因表达所必不可少的信号物质[10]。王勇等[11]对9种马尾松树针叶挥发性物质对松毛虫赤眼蜂的嗅觉行为反应，确定了α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、α-萜品醇乙酸酯4种对松毛虫赤眼蜂有影响活性的马尾松树针叶挥发性物质，其中尤以α-蒎烯和β-蒎烯2种物质作用最显著。据Boeve J L等[12～14]的研究表明：植物被昆虫咬食后，其局部和系统部位都会发生相应反应，但受害马尾松诱导邻近植株产生抗虫性的研究未见报道。本研究采用GC/MS对马尾松虫害植株与相邻健康株的挥发物进行了初步分析，旨在探讨虫害马尾松对邻近植株的挥发性物质是否具有诱导效应，研究结果初步表明受害马尾松体内的挥发物较对照明显增加，同时可以诱导邻近植物产生防御反应，这为进一步阐明植物的防御策略提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料

在桐庐县城关镇实验林场和杭州留下镇小和山林场试验基地各选择有松墨天牛（Monochamus alternatus）虫害的马尾松林样地，然后在样地里分别选择新枯死并有松墨天牛危害的马尾松与邻近（3 ～ 4 m）健康马尾松进行采样，并以样地无虫害马尾松林中的健康株为对照。

1.2 马尾松主干树皮的采集

在样地中选择具有代表性的虫害马尾松、邻近健康马尾松及其无虫害样地马尾松林中的健康植株按照上述采样点采集样品（在树干韧皮部上、中、下部采样，各部高度分别为5、3、1 m），样本大小为20 mm×20 mm ×1 mm，样品带回实验室后置于-18℃冰箱中保存，用于挥发性物质的测定。

1.3 挥发物的HS/SPME-GC/MS检测

1.3.1 预处理从冰柜中取出样品，在25℃的水浴中迅速解冻，精密称取1 g样品置于15 mL顶空瓶中，加入2.4 g NaCl（30%）溶液以促进香气成分的挥发，加入磁转子，立刻用PTFE/硅橡胶隔垫密封压紧。全部样品于50℃磁力搅拌器中平衡15 min，将老化后的PDMS/DVB/CAR萃取头插入样品瓶顶空部分于50℃吸附20 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于260℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

1.3.2 仪器的工作条件 GC/MS型号Agilent5975，HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.33 μm)；程序升温:起始温度40℃，保持2.5 min，以10℃/min的速度升温至200℃，保持6 min，检测器（FID）温度为250℃，进样口温度230℃，载气为氦气，流速1.0 mL/min。质谱接口温度为260℃，离子源温度200℃，电离方式EI，离子能量70 ev，扫描质量范围为33 ～ 450 amu。

1.3.3 挥发性物质的鉴定数据处理采用BF2002色谱工作站软件，通过计算机检索与NIST05质谱库提供的标准质谱图对照，选择匹配度大于800的鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 受害较严重区域虫害马尾松与相邻健康株主干树皮挥发物的比较

在马尾松受害较为严重的区域桐庐市城关镇实验林场，选择有虫害的马尾松林样地，然后在样地中分别选择有代表性的虫害马尾松、邻近健康马尾松和无虫害马尾松林中的健康株采集样品，采用HS/SPME-GC/MS分析受害马尾松与相邻健康主干树皮挥发物的变化情况，结果见表1。从表1可知，受害马尾松主干树皮挥发物的主要成分是萜烯类化合物，分别是1R-α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、石竹烯等，其次是十一烷和十二烷、十氢-4，8，8-三甲基-9-次甲基-1，4-亚甲基奥、2-乙烯基-萘等；从表1还可以看出：相邻健康株（与虫害植株相邻的健康株）其挥发性物质在种类及数量上明显少于虫害植株，也明显少于对照（无病区马尾松），即在虫害较为严重的区域，虫害前马尾松的挥发性物质处于抑制状态，虫害后则释放大量的挥发性物质并诱导邻近植株产生抗虫性。

表1 桐庐市虫害马尾松与相邻健康株主干树皮挥发物的比较Table1 VOCs from the damaged pine tree trunk and neighboring healthy one in Tonglu

2.2 虫害较轻区域虫害马尾松与相邻健康株主干树皮挥发物的比较

在马尾松受害较轻的区域杭州市西湖林场，选择有虫害的马尾松林样地，然后在样地中分别选择有代表性的虫害马尾松、邻近健康马尾松和无虫害马尾松林中的健康株采集样品，采用HS/SPME-GC/MS分析受害马尾松与相邻健康主干树皮挥发物的变化情况，结果见表2。从表2可知，虫害马尾松主干树皮挥发物的主要成分是萜烯类化合物，分别是1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-水芹烯、石竹烯和α-石竹烯等，其次是十一烷和十二烷、樟脑萜、十氢-4，8，8-三甲基-9-次甲基-1，4-亚甲基奥、2-乙烯基-萘等；从表2中还可以看出，虫害马尾松、相邻健康株与对照（无病区马尾松）的挥发性物质（除蒎烯外）在种类上差异不明显，而相邻健康株主干树皮中的挥发性物质1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯的含量则明显高于虫害马尾松和对照。因而我们认为1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯很可能是主要的信号传递物质。

表2 西湖林场虫害马尾松与相邻健康株主干树皮挥发物的比较Table 2 VOCs from the damaged pine tree trunk and neighboring healthy one in Hangzhou

3 结论与讨论

植物株内和株间存在着防御信息的交流，而这种信息传递的介质则是受伤植物释放出的挥发性化合物[15～18]。邓文红等[19]研究表明采用茉莉酸甲酯和萜烯混合熏蒸能够代替虫害等外界伤害的刺激，使马尾松启动相似的信号防御系统，达到防御外界伤害的作用，因而茉莉酸甲酯和萜烯可作为马尾松响应伤害的报警信号。本研究中α-蒎烯和β-水芹烯在健康植株中含量的明显变化（虫害较轻区域）也证明了这一点。

邓文红等研究虫食与熏蒸对马尾松挥发性化学物质的影响时发现，虫害和熏蒸处理后，水芹烯的相对含量在损伤枝、姊妹枝、系统上枝和系统下枝中均明显高于对照；β-蒎烯相对含量在损伤枝和姊妹枝中升高，而系统枝条中下降；α-蒎烯相对含量在所测 4个部位中除熏蒸后系统下枝升高外其余全部降低。本次研究结果也证明，在虫害较轻的区域，虫害马尾松、相邻健康株与对照（无病区马尾松）的挥发性物质（除蒎烯外）在种类上差异不明显，而相邻健康株主干树皮中的挥发性物质1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯含量则明显高于虫害马尾松和对照，这与邓文红等的研究结果基本一致。

另外马尾松在虫害前后其挥发性物质呈现出先抑后扬的变化规律，即在虫害较为严重的区域，相邻健康株（与虫害植株相邻的健康株）的挥发性物质在种类及数量上明显少于虫害植株，也明显少于对照，虫害前马尾松的挥发性物质处于抑制状态，虫害后则释放大量的挥发性物质并诱导邻近植株产生抗虫性；而在虫害较轻的区域中，虫害马尾松、相邻健康株与对照（无病区马尾松）的挥发性物质（除蒎烯和水芹烯外）在种类和数量上差异不明显。因此本研究结果证明：马尾松在植物株间存在着防御信息的交流，这种信息传递的介质可能是虫害后伤口释放出的挥发性化合物。然而虫害植株向邻近植株传递的最主要的信号物质是否为 1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯还有待于今后进一步证实，挥发性物质的具体调节机制也尚未明了，有待于今后作进一步研究。因此，今后将进一步从分子机理上阐明植物防御反应的相关机制，找出参与植物通讯的有效信号分子。

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Preliminary Study on Changes in Volatile Compounds from Damaged Pinus massioniana Trunk and the Neighboring Healthy One

WANG Li-xia1，XU Zhi-hong1*，CHEN Wei-min2，SUN Pin-lei2，WU Dong-jiang2，YU Chun-lai3，BAO Chun-quan4
（1. School of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Hangzhou Forest and Wild Animal Conservation Station of Zhejiang, Hangzhou 310009, China; 3. Chun’an Forest Pest Control and Quarantine Station of Zhejiang, Chun’an 311700, China; 4. Tonglu Forest Pest Control Station of Zhejiang, Tonglu 311500, China）

The composition and content of volatile organic compounds (VOCs) from damaged Pinus massioniana trunk and that from neighboring healthy one and the control was analyzed by HS/SPME/GC/MS. The results showed that major composition of VOCs from damaged tree was terpenes. Types and content of VOCs from damaged trees were evidently lower than that from the control. While types and content of VOCs from neighboring healthy trees were significantly higher than that from the control.

Pinus massoniana; neighboring tree; volatile organic compounds

S763.3

1001-3776（2013）06-0051-06

2013-07-01；

2013-10-08

“松材线虫病疫木除害和松褐天牛综合控制技术”杭财预〔2008〕144号、杭财预〔2009〕111号

王丽霞（1967-），女，浙江平湖人，副教授，博士，从事林产化工加工研究；*通讯作者。