黑牛肝菌多糖对小鼠酒精性肾损伤保护作用的研究

赵云霞，陶眀煊，*，程光宇，郭永月，邢 佳，彭 婕

（1.南京师范大学金陵女子学院，江苏南京210097；2.南京师范大学生命科学学院，江苏南京210046）

过量饮酒是当今世界范围内一个重要的公共卫生问题，长期大量饮酒会导致许多脏器系统的损害[1]。肝脏是酒精代谢的主要器官，也是最容易受损的器官。肾脏是仅次于肝脏的乙醇排泄器官。机体摄入酒精后约10%在肾脏代谢，这些水溶性外源物质在肾脏细胞和间质内积聚、浓缩，对肾脏可能造成一定程度的损害[2]。目前，国内外有关酒精性肝损害的研究已较为深入，但对酒精性肾损害研究报道较少[3-6]。有研究表明，乙醇可导致以肾小管-间质损害为主的病理改变，进而可进展至肾间质纤维化、慢性肾功能衰竭[7-10]。

黑牛肝菌（Boletus aereus，BA）是云南省资源较丰富的一种野生食用菌，其味道鲜美，具有很高的食用和药用价值。研究表明[11-13]，黑牛肝菌富含蛋白质、维生素、多糖、氨基酸和各种矿物质元素，对高血压，高胆固醇和高血脂等疾病均有较好的功效。本研究以黑牛肝菌为原材料，探讨了黑牛肝菌多糖对酒精所致小鼠肾损伤的保护作用，旨在为保健食品或天然药物的研制和开发提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑牛肝菌子实体干品 购自云南丽江市古城区喜玛拉雅贸易有限责任公司，经去杂质，剪去含培养基的根部，于60℃低温烘干后粉碎，过60目筛。将细粉经热水提取、浓缩、乙醇沉淀（1∶4，m/v）、低温干燥等步骤后，得到粗多糖，粗多糖经Sevage法脱蛋白、透析、乙醇沉淀、低温干燥后得黑牛肝菌精多糖，经测定多糖含量约为75.02%，蛋白含量为2.11%；ICR雄性小鼠 6周龄左右，体重（25.75±1.65）g，动物实验在江苏省中医院动物饲养中心进行，动物饲养许可证号（SYXK（苏）2012-0047）；四乙氧基丙烷 Fluka公司；谷胱甘肽（GSH）、牛血清白蛋白（BSA） Sigma公司；NBT、DTNB 南京卓尔生化有限公司；硫代巴比妥酸（TBA）、过氧化氢等生化试剂 为国产分析纯。

GL-22M型高速冷冻离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；722型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 小鼠适应性喂养3d，每组10只，随机分为模型组、药物组（联苯双酯组，150mg/kg bw）、RPBA各剂量组（100、200、400mg/kg bw），另取10只健康小鼠为空白对照组。受试样品用蒸馏水配制，每天灌胃一次，连续灌胃30d，实验期间供给全价颗粒饲料，不限制饮食饮水，空白对照组和模型组每天灌等体积的生理盐水。实验至第31d，各组动物禁食不禁水12h后，模型组、药物组及RPBA各剂量组以12mL/kg的量，灌以50%的乙醇溶液，建立动物急性肝损伤模型，空白组灌予等体积的生理盐水。各组小鼠均在灌胃12h后取肾脏测定各项抗氧化指标。

1.2.2 肾匀浆的制备 准确称取0.1g肾脏，用生理盐水洗去污血后拭干，剪碎并加入0.9mL预冷的50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8），于冰水浴中进行超声破碎（400W，20s×3）制成10%肾匀浆。肾匀浆于4℃条件下10000r/min离心10min，一部分上清液用于测定MDA、GSH含量，另一部分上清液以3∶1的比例加饱和硫酸铵溶液，同样条件下离心上清液即为粗酶液，用于测定SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 测定方法在Stewert和Bewly[14]NBT光还原法的基础上，略有改进。取1mL的缓冲液（空白组）、组织粗酶液（样品组）加入4mL NBT反应液中，照光3～5min，以加入缓冲液的避光的反应液作为空白对照，在722分光光度计上，于560nm波长测定各组的吸光度值。

1.2.4 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的测定 测定方法在Yao Ping等[15]DTNB法的基础上，略有改进。测定时取0.4mL 1.0mmol/L GSH+0.4mL 10%组织匀浆液作为样品管，取0.4mL 1.0mmol/L GSH+0.4mL双蒸水作为非酶管，37℃水浴预温5min，分别加入0.2mL预热的H2O2，3min后加4mL偏磷酸沉淀液，3000r/min离心10min，分别取上清液2mL+2.5mL 0.32mol/L Na2HPO4+0.5mL DTNB显色液；另取0.4mL双蒸水+1.6mL+2.5mL 0.32mol/L Na2HPO4+0.5mL DTNB显色液作空白管。混匀，室温放置10min后，以蒸馏水为空白对照，于420nm处测定吸光度。

1.2.5 过氧化氢酶（CAT）活性的测定 CAT活性的测定采用改进的紫外分光光度法[16]。

1.2.6 还原性谷胱甘肽（GSH）含量的测定 GSH含量按文献[17]测定，略有改进。取10%肝匀浆0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500r/min离心10min。取0.5mL上清液+4.5mL DTNB做测定管；另取0.5mL 4%磺基水杨酸+4.5mL DTNB做空白管。混匀，室温放置10min后，以空白管为空白对照，于420nm处测定吸光度。

1.2.7 过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量的测定 MDA含量的测定采用改进的硫代巴比妥酸（TBA）法[18]。

1.2.8 数据分析 实验数据用DPS 13.5统计软件进行统计学分析，单因素方差分析检验组间显著性差异，数据用x±s表示。

2 结果与分析

2.1 RPBA对小鼠体重增长的影响及对酒精损伤小鼠一般情况的观察

由表1可知，造模前后各组小鼠体重没有显著性差异，说明酒精对其生长没有显著地影响。观察期造模后的表现，发现给予50%的乙醇后，小鼠先表现出兴奋状态，继而行走不稳，摇摆，四肢瘫软，转身困难，半小时后重者嗜睡、醉倒，呼吸急促，此状态一直持续1h左右。空白组小鼠精神良好，食欲旺盛，毛色光滑有光泽；12h后模型组小鼠状态普遍较差，精神萎靡不振，毛色粗糙无光泽，活动减少。与模型组相比，阳性对照组、RPBA各剂量组小鼠精神状态、毛色和光泽有着显著改善，这说明RPBA对酒精性损伤有一定的保护作用。

2.2 RPBA对小鼠肾损伤后SOD、GSH-Px、CAT的活性影响

由表2可见，造模后肾组织中SOD、GSH-Px、CAT的活性均明显低于空白对照组（p＜0.01），给予RPBA后，SOD、CAT活性呈剂量-效应关系增加，其中中、高剂量组SOD活性已与空白对照组基本相当，高剂量组CAT活性已与药物组水平相当；GSH-Px活性虽未达到药物组水平，但随着多糖剂量的上升，GSH-Px的活性逐渐上升，呈一定的量效关系。说明RPBA能显著提高小鼠肾脏SOD、GSH-Px、CAT活性，增强机体清除自由基、H2O2的能力，减轻其对小鼠肾脏的损害作用。

表2 RPBA对小鼠肾SOD、GSH-Px、CAT活性的影响（x±s，n=10）Table 2 Effect of RPBA on SOD、GSH-Px、CAT activity inkidney of mice（x±s，n=10）

2.3 RPBA对小鼠肾损伤后GSH和MDA含量的影响

表3 RPBA对小鼠肾GSH和MDA含量的影响（x±s，n=10）Table 3 Effect of RPBA on GSH and MDA contents in kidney of mice（x±s，n=10）

由表3可见，造模后小鼠肾脏GSH水平显著低于空白对照组（p＜0.01），给予RPBA后，虽未达到药物组水平，但低、中、高剂量组GSH水平均有所增加，并呈一定剂量关系，说明RPBA能一定程度地提高肾损伤小鼠非酶体系的抗氧化能力；造模后模型组MDA水平高于空白组，呈显著性差异（p＜0.01），给予RPBA后，多糖各剂量组MDA水平均有显著降低，其中高剂量组达到空白对照组水平，说明RPAB能有效改善肾损伤小鼠体内的脂质过氧化水平。

3 讨论

自由基学说认为，自由基的增多是产生衰老和死亡的重要因素。在正常的生物代谢过程中，细胞会产生O2-·等自由基，它们可以迅速地被细胞内的防御系统所消除，不造成危害。但在某些异常因素如放射性物质、药物、酒精等的影响下均会引发正常代谢外的异常自由基反应，这些异常自由基反应产生的大量自由基不能完全被防御系统所清除，因而就会在细胞内积累并扩散至细胞外，氧化蛋白质、核酸和脂肪，从而损害细胞的结构和功能。近期研究[19-21]认为，自由基与造成肾脏损伤的机制有关，深入研究食用菌多糖对体内自由基清除活性，将有助于开发天然高效抗氧化物质。

机体内的自由基清除率防御体系主要由抗氧化酶体系和非酶体系组成。SOD、GSH-Px、CAT三种酶组成生物体最主要的抗氧化酶防御体系。它们能有效清除活性氧自由基，终止自由基链式反应，在抗氧化方面起了重要作用。当这些酶活性降低时，会导致自由基积累，破坏细胞膜的完整性，并引起功能的丧失[22]。GSH是非酶体系中重要的还原产物，它能迅速清除细胞内的氧自由基，有效地防止脂质过氧化[23]。MDA是体内自由基攻击脂质产生脂质过氧化物的代谢最终产物，可间接反映出细胞损伤的程度[24]。

食用菌多糖能从整体上提高机体免疫力，尤其是抗氧化，保护生物膜和延缓衰老作用。国内外关于食用菌多糖抗氧化活性方面的报道已经很多，如有平菇多糖、云芝多糖、金顶侧耳多糖、香菇多糖、茶树菇多糖、双孢菇多糖、姬菇多糖、猴头菇多糖等等[25-32]，其中金顶侧耳多糖能显著提高肾损伤小鼠的SOD等抗氧化酶活性和GSH含量，姬菇多糖在降低肾损伤小鼠MDA水平方面有很好的作用。与上述研究结果一致，本实验显示黑牛肝菌多糖能提高SOD、CAT、GSH-Px的活性，增加肾组织GSH含量，降低肾匀浆MDA含量。其机制可能是RPBA预处理可以提前增强机体的自由基清除防御体系，可以有效地拮抗急性酒精所导致的抗氧化酶活性降低及GSH耗竭，抑制自由基介导的脂质过氧化反应，增强脂肪酸在细胞内代谢，保护细胞膜，促进细胞的再生和修复。实验结果说明黑牛肝菌多糖在预防自由基诱发氧化肾脏组织损伤方面，是具有开发前景的一种天然的高效抗氧化剂。

4 结论

从小鼠一般情况观察，模型组小鼠精神萎靡不振，毛色粗糙无光泽，活动减少，状态普遍较差；而饲喂RPBA各剂量组的小鼠精神状态、毛色和光泽有着显著改善。

从体内抗氧化方面分析，模型组小鼠肾脏抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT酶活性下降，抗氧化物质GSH含量减少，脂质过氧化终产物MDA含量增加；而饲喂RPBA各剂量组的小鼠肾脏抗氧化酶SOD、GSHPx和CAT酶活性显著升高（p＜0.01），且存在一定的剂量关系，GSH含量随RPBA剂量的增加逐步恢复到正常水平；MDA含量显著降低（p＜0.01）。说明RPBA能显著提高肾脏中抗氧化酶活性，减少脂质过氧化，对小鼠酒精性肾损伤具有明显的保护作用。

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