“复瓣玫瑰红”组织培养快繁体系的建立

刘建民，薛其勤，李美芹，吕金浮，裴华丽，乔 宁

（潍坊科技学院蔬菜花卉研究所，山东 寿光 262700）

“复瓣玫瑰红”组织培养快繁体系的建立

刘建民，薛其勤，李美芹*，吕金浮，裴华丽，乔 宁

（潍坊科技学院蔬菜花卉研究所，山东 寿光 262700）

以“复瓣玫瑰红”茎段为外植体，进行腋芽取材时期、腋芽节径、培养基中无机盐离子浓度、不同激素配比和组培苗驯化移栽试验。结果表明：“复瓣玫瑰红”蔷薇取材的最佳时期是5月和11月，所取材料是当年生枝条的中间部分，采用1/2MS为基本培养基并添加0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L6-BA的激素组合腋芽萌发效果最好，其萌发率最高可达100%；腋芽分化的最佳培养基为：1/2MS+0.2 mg/LNAA+2.0 mg/L6-BA，增殖系数达到8.3；最佳生根培养基为1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA组合，生根率可达97.1%；组培苗移栽时，以纯蛭石为基质，先将生根瓶苗移至炼苗室进行9 ~ 13 d的移栽前锻炼，并保持雾状喷水，移栽成活率可达80.0%。

“复瓣玫瑰红”蔷薇；组织培养；快速繁殖

蔷薇属蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）植物，是世界著名的观赏植物之一，其花色鲜艳、芳香浓郁，在我国园林绿化中应用普遍[1~2]。“复瓣玫瑰红”蔷薇是潍坊科技学院蔬菜花卉研究所选育的新品种。该品种的适应性、抗病性强，花型大、花期长、颜色鲜艳，具有较高的观赏价值、经济价值及应用前景。

蔷薇通常采用嫁接、扦插、组培等方法进行繁殖。采用嫁接和扦插进行该品种快繁，其繁殖系数较低，而采用组织培养技术繁殖，既可以得到整齐一致的无性系繁殖材料，又能提高繁殖系数，而且不受繁殖材料的限制，可在短期内获得大量苗木。目前国内外已有不少关于蔷薇属植物的组培报道[3~5]，但有关蔷薇组培的报道较少，有关蔷薇组培快繁体系还不完善，存在着诱导率、增殖系数和生根率低等问题；并且不同品种的蔷薇所要求的组培条件差异较大[6~8]。因此有必要开展”复瓣玫瑰红”蔷薇组培快繁体系的研究，建立成熟的繁殖体系，为新品种的推广应用奠定基础。

本研究对影响“复瓣玫瑰红”蔷薇组织培养快繁的因素进行探讨，主要从腋芽的取材时期、腋芽节位、培养基中无机盐离子浓度和激素配比等对”复瓣玫瑰红”蔷薇组培快繁的影响，建立一套“复瓣玫瑰红”蔷薇高效离体快繁技术体系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

取潍坊科技学院试验田内培养的当年生”复瓣玫瑰红”蔷薇茎段，分别取上、中、下部腋芽为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒与初代培养 取当年生枝条，剪去叶片，用吐温-20和清水冲洗3 ~ 5次，分上（完全未木质化）、中（半木质化）、下（完全木质化）3种腋芽，剪成含有一个腋芽的茎段，做好标记，分别处理：先后浸于75%的酒精中10 s、0.1%HgCl2溶液中20 min，进行表面消毒，再用无菌水漂洗4次。用无菌滤纸吸干外植体多余的液体，用已消毒处理过的手术刀切去每个带芽茎段的两端，腋芽朝上竖插，接种于初代培养基上，每日13 h，在25℃、光照3 000 lx下培养，促使腋芽萌发。

1.2.2 不同取材时期对蔷薇腋芽萌芽的影响 2011年5-11月，分别于5、7、9、11月的上旬，于晴朗的上午采蔷薇植株当年生新梢。接种于1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的诱导培养基上，每个处理接种外植体数目为30个，重复2次。20 d后统计腋芽萌发率，其计算公式如下：

腋芽萌发率% =（腋芽萌发的带芽茎段数/接种的带芽茎数）×100%

1.2.3 无机盐离子浓度对腋芽萌发的影响 于2011年9月上旬，取“复瓣玫瑰红”蔷薇当年抽出的新枝条，从枝条顶端开始分成上、中、下3种腋芽，剪成带有一个腋芽的茎段，接种于添加0.1mg/L NAA和l.0mg/L6-BA的MS、1/2MS、1/4MS培养基上，每种材料接种数目30个，重复2次，20 d后统计腋芽萌发率。

1.2.4 诱导培养基的激素组成对蔷薇腋芽萌发和丛生芽诱导的影响 将消毒处理的茎段接种于含有 NAA和6-BA组合的1/2MS诱导培养基上。每处理接种30株外植体，重复2次。20 d后统计腋芽萌发率。

初代培养分化的不定芽和直接分化的试管苗长到2 ~ 3 cm时，将其纵切分成单株，之后每株再分成单芽接种于添加NAA和6-BA组合或者添加NAA和IBA组合的增殖培养基上（见表1）。每瓶接种6个，每个处理每次接种5瓶（30个芽），重复2次。培养30d后，统计每个处理的新生芽数，增殖系数计算公式如下：

增殖系数 = 新生芽数/原来接种芽数

1.2.5 无菌苗的壮苗与生根培养 当再生小苗长到3 ~ 4 cm时，切取单株幼苗，接种于添加0.1 ~ 0.7 mg/L NAA、0.5 ~ 4 mg/LIBA和0.1 ~ 0.4 mg/L6-BA的1/2MS培养基诱导生根，长成完整植株。每个处理接种20株幼苗，重复2次，30 d后统计生根率和根系生长情况。

生根率 =（已生根的苗数/接种的组培苗数）×100%

1.2.6 驯化与移栽 待试管苗在生根培养基内长出5 ~ 6条、长1 ~ 3 cm的粗壮根时，进行试管苗的驯化移栽。移栽前先将生根瓶苗移至炼苗室9 ~ 13 d，进行移栽前的锻炼，使其适应外界的光照、温度。移栽试验在温室中进行，选用3种基质，分别为蛭石、珍珠岩、蛭石+珍珠岩（1：1）。将小苗从瓶内取出，洗净附着在根上的培养基，栽植于3种基质中。移入基质后，保持雾状喷水，使环境相对湿度保持在90 %以上，无需设置保温保湿的小环境，一周后喷施营养液。60 d后可移栽至大田，统计成活率。

成活率 =（已成活的苗数/移栽的总苗数）×100%

表1 增殖培养基的类型Table 1 Types of medium for multiplication mg/L

2 结果与分析

2.1 初代培养

2.1.1 不同取材时期对腋芽萌发的影响 由图1可见，接种材料的采集时期较为显著地影响腋芽的萌发，以5月和11月采集的枝条萌发效果较好，萌芽率分别达到90.32%和98.21%；7月最低，其萌芽率为68.49%。原因是5月初田间蔷薇刚刚萌动，体内养分充足，激素水平适宜于芽的萌发；11月蔷薇体内充分积累养分，腋芽非常饱满。所以，11月是取材的最好时期，并且在11月取的材料培养5 d后就开始萌发，萌发所需时间最短，且生长旺盛。在此试验中，整体发芽率普遍较高，可能是因为选用的培养基较适于萌发的原因。

2.1.2 无机盐离子浓度对腋芽萌发的影响 由图2可以看出，无机盐浓度显著影响腋芽的萌发，基本培养基为1/2MS时，3种腋芽的萌发率都是最高。接种材料的腋芽部位对其萌发效果影响显著，以枝条的中间位置，也就是半木质化枝条的腋芽萌发效果最好，在1/2MS培养基上萌芽率为89.9%；而木质化部分最低，在1/2MS培养基上萌芽率为 67.3%。半木质化枝条的腋芽萌发率高，是由于半木质化枝条上腋芽的分生能力强、内源激素水平利于芽萌发。

图1 不同取材时间对腋芽萌发的影响Figure 1 Effect of sampling time on germination of bud

图2 不同无机盐离子浓度对腋芽萌发的影响Figure 2 Effect of different medium on germination of bud

2.2 诱导培养基的激素组成对腋芽萌发和丛生芽诱导的影响

2.2.1 诱导培养基的激素组成对蔷薇腋芽萌发的影响 由表2可以看出，激素及其配比显著影响腋芽萌发，NAA浓度为0.1mg/L时，腋芽萌发率较好，其中以l/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的组合最好；而l/2MS+ 0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA和l/2MS+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA的组合，其腋芽萌发率也较高，但萌发出的小苗玻璃化现象较为严重，尤其是l/2MS+0.1 mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA组合。NAA浓度为0.2 mg/L时，腋芽萌发率达88%左右，其萌发率不及NAA浓度为0.1 mg/L的组合，并且也有部分小苗出现玻璃化现象。

2.2.2 不同激素配比对蔷薇丛生芽诱导的影响 由图3可以看出，在NAA和6-BA组合中，l/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA的组合，其腋芽增殖效果最好，增殖系数达到8.3，生长旺盛；其次是l/2MS+0.3 mg/L NAA +1.0mg/L 6-BA的组合，其增殖系数为7.8。NAA在0.1 mg/L的水平上，6-BA的浓度为3 mg/L时，增殖系数最高；并且随着6-BA浓度的增加，其增殖系数有升高的趋势，但再生苗的玻璃化现象加重。NAA在0.2 mg/L的水平上，随6-BA浓度的升高，增殖系数呈先增后减的趋势，6-BA的浓度在2 mg/L的水平上增殖系数最高，并且再生苗的叶色墨绿、生长正常。NAA在0.3 mg/L的水平上，6-BA的浓度在1 mg/L的水平上增殖系数最高，随着6-BA浓度的升高，增殖系数呈现下降的趋势。6-BA在1 mg/L的水平上，随NAA浓度的增加，其增殖系数有升高的趋势；6-BA在1.5 ~ 2.5mg/L的水平上，随NAA浓度的增加，增殖系数呈先增后减的趋势，其中以1.5 mg/L最为显著；6-BA的浓度在3 mg/L的水平上，随NAA浓度的增加，增殖系数呈现下降趋势。

图3 不同激素组合对丛生芽诱导的影响Figure 3 Effect of different hormones ratio on induction of clump shoot

在IAA和6-BA的组合中，l/2MS+0.1 mg/L IAA+1.0 mg/L 6-BA的组合最好，其增殖系数为2.9。在IAA为0.1 mg/L的水平上，随着6-BA浓度的升高，增殖系数呈现先增后减的趋势。IAA在0.2和0.3 mg/L的水平上，随6-BA浓度的升高，增殖系数呈现增高的趋势，但总体增生系数都较低。6-BA在0.5 ~ 1.5 mg/L的水平上，随IAA浓度的增加，增殖系数呈现下降的趋势；6-BA的浓度在2.0 mg/L的水平上，随IAA浓度的增加，增殖系数呈现先增后减的趋势。

总之，本试验组合中，NAA和6-BA组合增殖效果优于IAA和6-BA组合。

2.3 壮苗生根培养

2.3.1 激素配比对壮苗生根培养的影响 从表3中可以看出，当只添加NAA时，随着NAA浓度的增大，生根率有降低的趋势，愈伤组织的呈加重趋势。在NAA和6-BA的组合中，NAA在0.1 mg/L的水平上时，整体生根率最高，其中1/2MS+0.1 mg/L NAA+ 0.2 mg/L 6-BA组合生根率最高；NAA在0.3 ~ 0.7 mg/L的水平上时，随6-BA浓度的增大，生根率有上升的趋势，但总体上还是随NAA浓度的增加，生根率下降。在NAA和IBA的组合中，NAA在0.1 mg/L的水平上时，整体生根率水平最低，并随IBA浓度的升高，生根率有降低的趋势；NAA在0.3 mg/L的水平时，整体生根率最高，其中1/2MS+0.3 mg/L NAA+2 mg/L IBA组合生根率最高；NAA在0.5 ~ 0.7 mg/L的水平时，随IBA浓度的增大，生根率有上升的趋势，但总体上还是随NAA浓度的增加，生根率下降。

表3 不同激素及其配比对不定根形成的影响Table 3 Effect of different hormones and ratio on rooting rate

2.4 组培苗的驯化与移栽

在生根培养基内培养20 d即可形成较健壮的根，平均每株可生根8 ~ 12条，根长1 ~ 3 cm，株高4.0 ~ 7.0 cm，此时可准备移栽。移栽前先将生根瓶苗移至炼苗室9 ~ 13 d，进行移栽前的锻炼。

在移栽试验中，以纯蛭石为基质移栽成活率最高，为80%以上；蛭石：珍珠岩（1：1）成活率为72%；以珍珠岩为基质，移栽成活率低于前二者。从珍珠岩与蛭石的物理性能看，蛭石吸水性及保水性均优于珍珠岩；色深，吸热性能好；质地比珍珠岩致密，散热慢，基质温度、尤其是夜间温度高，有利于新根的形成。

试管生根苗，移入基质后，保持雾状喷水，相对湿度保持在90%以上，一周后喷施营养液。本移栽试验证明，其移栽成活率可达80%以上，60 d后可移栽至大田。

3 结论

试验结果表明，“复瓣玫瑰红”蔷薇的组织培养快速繁殖体系的建立受多种因素的限制，外植体的取材时期和部位、培养基的无机盐离子浓度、激素组成对其组织培养快繁体系的建立具有显著影响。

“复瓣玫瑰红”蔷薇取材的最佳时期是5月和11月，所取材料是当年生枝条的中间部分，采用1/2MS为基本培养基并添加0.1mg/L NAA+1.0 mg/L6-BA的激素组合腋芽萌发效果最好，其萌发率最高可达100%，腋芽分化的最佳培养基为：1/2MS+0.2 mg/LNAA+2.0 mg/L6-BA，增殖系数达到8.3。生根试验表明，采用1/2MS为基本培养基并添加0.1mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA组合生根率最高，可达97.1%。组培苗移栽时，以纯蛭石为基质，先将生根瓶苗移至炼苗室进行9 ~ 13 d的移栽前锻炼，并保持雾状喷水，移栽成活率可达80.0%。

[1] 俞德俊. 中国植物志[M]. 北京：科学出版社，1985. 360-455.

[2] Wu Z Y, Hong D Y. Flora of China（9）[M]. Beijing：Science Press，2001. 339-382.

[3] 丁雪珍. 大马士革蔷薇的组织培养与快速繁殖[J]. 山东林业科技，2008，38（3）：51-52.

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[6] 刘根林，梁珍海，朱军. 活性炭在植物组织培养中的作用概述[J]. 江苏林业科技，2001，28（5）：46-48.

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Establishment of Rapid in-vitro Propagation System for Rosa multiflora var. ‘multipetal Rose-red ’

LIU Jian-min，XUE Qi-qin，LI Mei-qin*，LU Jin-fu，PEI Hua-li，QIAO Ning
（Weifang University of Science and Technology, Shouguang 262700, China）

Experiments were conducted on effect of sampling time, explants types, different cultures and different hormones ratio on rapid in-vitro propagation of Rosa multiflora var. ‘multiprtai Rose-red’ using the stem segment as the explant. The results showed that the best sampling time was in May and November, the best stem segment was the semi-lignified branches in the middle of the shoots. The germination rate of bud topped to 100% when the medium was 1/2MS supplemented with 0.1mg/L NAA and l.0mg/L 6-BA. The optimal medium for multiplication of adventitious buds was 1/2MS supplemented with 0.2mg/L NAA and 2.0mg/L 6-BA, and the multiplication coefficient was up to 8.3. The best medium for rooting was 1/2MS supplemented with 0.1mg/L NAA and 0.2mg/L 6-BA, and the rooting rate was up to 97.1%. The conservation rate after transplanting reached up to 80.0% using the pure vermiculite as substrate after 9-13 days acclimatization, and keeping mist spray.

Rosa multiflora var. ‘multiprtai Rose-red’; rapid propagation; tissue culture in vitro

S723.1+32.6

B

1001-3776（2013）05-0057-05

2013-04-29；

2013-06-19

山东省高等学校科技计划项目（J10LC78）

刘建民（1968-），男，山东寿光人，副教授，从事植物生物技术研究；*通讯作者。