活血胶囊质量标准的研究

2013-05-05郝玉英菅艳艳石妍邱爱梅杨永利杨常敏

中国药物经济学 2013年1期

郝玉英菅艳艳石妍邱爱梅杨永利杨常敏

活血胶囊质量标准的研究

郝玉英菅艳艳石妍邱爱梅杨永利杨常敏

目的建立包头市中心医院临床验方中药制剂活血胶囊的质量标准。方法采用薄层色谱法，对活血胶囊中红花、黄芪、川芎进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A含量。色谱柱采用Agilent TC-C18柱（150mm ×4.6mm，5μm）；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72）为流动相；检测波长为403.0nm。结果检测的结果是羟基红花黄色素A呈良好的线性关系，条件是在0.1372～0.9601μg范围内，r=1，平均回收率99.0%，RSD=0.8%（n=6）。结论该方法简便、准确、可靠，可作为活血胶囊的质量控制方法。

活血胶囊；质量标准；TLC；HPLC；羟基红花黄色素A

活血胶囊是我院多年使用的临床验方，由川芎、红花、黄芪等8位药物组成；具有破血逐瘀，通窍止痛的功效。临床上主要用于治疗脑梗塞后循环缺血、脑供血不足、周围神经病变、神经损伤等疾病引起的半身不遂、言语不利、口眼歪斜、肢体麻木等症。为控制活血胶囊的质量，采用了薄层色谱法对该制剂中的川芎、红花、黄芪进行了定性鉴别；对制剂中的羟基红花黄色素A进行含量测定时采用的是高效液相色谱法从而有效的控制了活血胶囊的质量。

1 定性鉴别

本品为药材粉末和提取物制成的胶囊，方中红花和黄芪的显微特征都比较明显，故建立显微鉴别，并对处方中的川芎、红花、黄芪建立了薄层鉴别。

1.1 仪器与试药由本院提供（批号：20111227、20120128、20120324），模拟样品为自制。川芎对照药材（批号：120918-201110）：中国药品生物制品检定研究院购买。红花对照药材（批号：120907-200609）：中国药品生物制品检定研究院购买。黄芪对照药材（批号：120974-200609）：中国药品生物制品检定研究院购买。硅胶G（薄层色谱用）：青岛海洋化工厂生产。铺板器（939型薄层铺板器）：重庆贝可得公司生产。薄层板：为包头市食品药品检验检测中心自制。试剂：薄层色谱鉴别所用试剂均为分析纯。

1.2 显微鉴别正文中各鉴别特征所代表的药材分别为：纤维成束或散离，直径8～30μm，壁厚，表面有纵裂纹，初生壁常与次生壁分离，两端常断裂成须状，或较平截（黄芪）。花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约至60μm，具3个萌发孔，外壁有齿状突起（红花）。

1.3 薄层鉴别

1.3.1 川芎的鉴别取本品粉末10g，加乙醚50ml，通过1h的加热回流，进行过滤，将滤液挥发掉，剩余的残渣中加入2ml乙醚使其溶解，所得液体作为试品溶液。另外取出1g川芎对照药材，通过同样的方法得到溶液。在试验时使用薄层色谱法，取10μl上述两种溶液，分别将这两种液体点在同一硅胶GF254薄层板上，展开剂使用己烷-乙酸乙酯(3：1)，后取出并晾干，放在外光灯(254nm)下检视，最后放在供试品色谱中，能够在色谱上相应的位置上出现荧光斑点（图1）。

1.3.2 红花的鉴别取本品粉末10g，加80%丙酮溶液20ml，密塞，超声处理20min，滤过，作为供试品溶液。同时取出0.5g红花对照药材，用同样的方法制成对照药材溶液。通过薄层色谱法进行试验，将上述两种液体分别取出10μl，同时将两种液体分别在同一硅胶G薄层板上进行点滴，展开剂使用乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)，后取出并晾干。在供试品色谱中能够显出相同颜色的斑点（图2）。

图1 活血胶囊中川芎的薄层色谱鉴别方法学研究图

图2 活血胶囊中红花的薄层色谱鉴别方法学研究图

1.3.3 黄芪的鉴别取出5g黄芪粉末，加入30ml乙醚，通过20min的加热回流，进行滤过之后得到残渣，残渣加0.3%氢氧化钠溶液15ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH值至5～6，用乙酸乙酯15ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，用滤纸将溶液滤过，滤纸上要铺上适量的无水硫酸钠，将滤液蒸干。所得残渣中加入1ml乙酯让残渣溶解，所得液体作为供试品溶液。取出1g黄芪作为对照药材，同样的方法制成对照药材溶液。通过薄层色谱法进行试验，取出10μl上述两种液体，将它们点在同一硅胶G薄层板上，展开剂使用三氯甲烷-甲醇(10：1)，将液体展开之后取出晾干，放在氨蒸气中熏后，再放在紫外光灯下进行检视。这时，在供应品色谱中，对照的位置上能够显出同样颜色的荧光性斑点（图3）。

图3 活血胶囊中黄芪的薄层色谱鉴别方法学研究图

2 羟基红花黄色素A的含量测定

本品为川芎、红花、黄芪等8味药组成的复方制剂。文献报道红花主要含黄酮类化合物、脂肪酸、色素、挥发油及多炔等化合物。通过《中国药典》中对红花含量的测定方法，对羟基红花黄色素A含量测定时采用HPLC法。经过特定的分析方法进行验证，能够看出此法具有较好的重现性，同时有着较强的专属性，不会干扰其它组分对羟基红花黄色素A的测定，所以可以纳入质量标准之中。

2.1 仪器与试药

2.1.1 仪器岛津LC-10ATvp泵，SPD-10Avp型检测器，岛津CLASS-VP工作站，Sartorious BP211D型电子天平。UV-1100型紫外分光光度仪（北京瑞利分析仪器公司）。

2.1.2 试剂与试药用羟基红花黄色素A作为试剂（111637-200905，含量以91.8%计，供含量测定用）：从中国药品生物制品检定研究院购买；活血胶囊（批号：20111227、20120128、20120324）由包头市中心医院提供；模拟样（20120328）自制；色谱纯使用乙腈、甲醇，水为高纯水，分析纯使用其他试剂。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件

2.2.1.1 色谱拉把十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填充剂，采用AgilentTC-C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）作为本实验研究。

2.2.1.2 流动相的选择对羟基红花黄色素A选择的测定方法采用流动相的形式，对流动相进行流动相条件摸索以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72），在结果供试品色谱中的羟基红花黄色素A具有较好的分离度，同时有着较高的理论板数，并且能够长时间保存，所以作为检测的流动相。

2.2.1.3 柱温室温。

2.2.1.4 检测波长的选择取羟基红花黄色素A对照品适量，使用25%甲醇，制作成1ml含40μg的溶液，在300～500nm波长范围扫描。得出羟基红花黄色素A在403.0nm处有最吸收。在检测时参照中国药典2005年版一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法，检测波长选择403.0nm进行。

2.2.1.5 理论板数的确定根据多批检测数据中可以看出，要想羟基红花黄色素A得到较好的分离效果，理论板数在4000以上即可。但由于不同的色谱柱具有不同的理论板数，故确定理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。

2.2.2 溶剂提取及提取效率的考察

2.2.2.1 选择提取溶剂测定方法可以参照《中国药典》2010年版一部“红花”项下的羟基红花黄色素A中含量的测定，提取剂为25%的甲醇。

2.2.2.2 考察提取效率提取剂为25%的甲醇50ml进行超声提取，采用超声法提取，为确保将被测成分完全提取出来，选取30min、40min和50min不同的提取时间来考察对提取效率的影响（见表1）。

表1 提取效率试验

从表中数据可见，超声处理30min、40min和50min羟基红花黄色素A的含量基本一致，故超声提取时间定为40min。

2.2.2.3 提取溶剂加入量考察在特定的提取过程中，考察溶剂的加入量，结果见表2。

表2 提取完全试验的考察表

从表中数据可见，用25ml溶剂的样品羟基红花黄色素A含量较低，用50ml和75ml溶剂的样品羟基红花黄色素A含量基本一致，提取完全，所以确定提取溶剂加入量为50ml。

2.2.3 专属性阴性对照试验：在制备供试品溶液和对照品溶液的时候按照《中国药典》2010年版一部“红花”项下的羟基红花黄色素A【含量测定】项下的方法制备。制备的缺红花的阴性对照供试品按照相应的处方比例采用相同的工艺，按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。在上述色谱的条件下，精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各20ml，分别注入液相色谱仪，得出阴性对照色谱图和羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图在相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰（见图4～6）。

图4 阴性样品图

图5 羟基红花黄色素A对照品样品图

图6 活血胶囊样品图

2.2.4 线性关系考察精密称取出适量的取羟基红花黄色素A对照品适量，加入甲醇（浓度为25%）制成1ml含0.6mg的溶液作为对照品溶液；精密量取上述对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，置于10ml容器瓶加入甲醇至刻度，摇均匀。取10μl液体至色谱仪进行测定，得出羟基红花黄色素A在0.1372～0.9601μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=14930+32464X，r=1（见表3）。

表3 羟基红花黄色素A的标准曲线

2.2.5 稳定性试验选取同一份供试品溶液，分别在0h、2h、4h、、8h、12h进行测定，结果见表4。

表4 不同时间测定样品中羟基红花黄色素A的峰面积积分值

从表中的数据可以看出，在12h内羟基红花黄色素A的峰面积积分值基本稳定不变。

2.2.6 精密度选取样品（批号：20111227），研细，取6份，按照《中国药典》2010年版一部“红花”项下的羟基红花黄色素A项下的方法操作，测定每份样品的含量（见表5）。

表5 羟基红花黄色素A含量重复性试验结果

2.2.7 准确度精密称定实验供试品（含量0.07mg/粒)9份，每份约1.5g，分别置9个具塞锥形瓶中，同时分为三组，每组为三份，加入浓度为0.4284 mg/ml的羟基红花黄色素A溶液，容量分别为1ml、1.2ml、1.5ml（约相当于供试品含有量的80.0%、100%、120%），同时加入25%的甲醇溶液各50ml，总体积为51.0ml、51.2ml和51.5ml，测定每份含量，计算回收率，具体结果见表6。