RNAi技术体外沉默肌肉环指蛋白1的研究

朱志祥 梁炳生 冯勇 达志峰 丁洁 韦建 贾英伟

•论著•

RNAi技术体外沉默肌肉环指蛋白1的研究

朱志祥 梁炳生 冯勇 达志峰 丁洁 韦建 贾英伟

目的探讨RNAi技术体外抑制大鼠肌肉环状指蛋白1（MuRF-1）基因表达的效果，筛选出针对MuRF-1基因最有效的siRNA重组质粒。方法根据大鼠MuRF-1基因的mRNA序列，设计4组干扰序列，即siRNA MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，利用lipofactamine 2000转染试剂将siRNA重组质粒转染大鼠成肌细胞系L6，于转染后48 h与72 h，采用实时定量PCR和Western blot或免疫印迹检测其对MuRF-1表达的抑制效果。MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后mRNA和蛋白质数据以x ± s表示。对照组与四组实验组的比较用单因素方差分析；多个样本均数的两两比较用LSD检验。结果（ 1）实时定量PCR显示四组干扰质粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对基因MuRF-1的mRNA的抑制率在转染后48 h分别为67﹪、31﹪、11﹪，20﹪，不同干扰序列的抑制效果有差异（F = 4.527，P = 0.024）；72 h分别为79﹪、59﹪、50﹪和61﹪，不同干扰序列的抑制效果有差异（F = 19.088，P ＜ 0.001），与48 h相比，抑制效应更为明显，但以siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显（t = 8.201,P ＜0.001）。（2）使用Western印迹灰度分析显示四组干扰序列对基因MuRF-1的蛋白的抑制率在转染后48 h分别为61﹪、40﹪、9﹪和15﹪，不同干扰序列的抑制效果有差异（F = 4.286，P = 0.028）；72 h分别为70﹪、54﹪、30﹪和46﹪，不同干扰序列的抑制效果有差异（F = 3.731，P = 0.042）；与48 h相比，MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效应与对照组相比有显著性差异（tⅠ= 3.256，P = 0.009；tⅡ= 2.512，P = 0.03），但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ与对照组相比仍无显著性差异（P ＞ 0.05）。四对序列中，以siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显。蛋白水平的抑制效果与mRNA水平基本一致。结论 成功筛选出对MuRF-1基因有效的siRNA重组质粒，即siRNA MuRF1-Ⅰ，为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。

成肌细胞； L6； MuRF-1； 质粒转染； RNA干扰

肌肉环状指蛋白1（muscle RING fi nger protein 1，MuRF-l）基因是近年来新发现的骨骼肌特异表达的泛素蛋白连接酶，在多种原因所致的骨骼肌萎缩模型中mRNA水平表达明显上调，被认为是与骨骼肌蛋白降解有关的特异性基因，是多种肌萎缩的重要标志[1-3]。本实验在细胞水平，通过RNAi技术，采用lipofactamine 2000转染构建好的质粒于大鼠成肌细胞L6，用实时定量PCR和Western blot或免疫印迹方法检测转染MuRF-1基因后mRNA及蛋白的变化，以期筛选出针对MuRF-1基因最有效的siRNA重组质粒。

材料和方法

一、实验试剂与主要仪器

大鼠骨骼肌成肌细胞系L6（美国ATCC公司），质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR（上海锐赛生物技术有限公司），胎牛血清为（美国Gibco公司），DMEM（高糖）细胞培养液（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），Genelute Plasmid MiniPrep Kit（美国Sigma公司），Lipofectamine 2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）。

二、实验方法

1. MuRF-1基因的siRNA重组质粒的制备：查阅相关文献获取目的基因miRNA干扰序列，针对大鼠MuRF-1基因序列设计并合成4个miRNA干扰序列，经合成、载体构建、酶切鉴定、测序正确及细胞实验筛选出有效干扰序列（siRNA重组质粒：由上海锐赛生物技术有限公司构建并鉴定siRNA重组质粒）。

2.细胞培养：L6细胞系用含10﹪胎牛血清的DMEM-HG，置于5﹪CO2、37℃条件下培养、传代。

3.实验分组：本实验设立MuRFl基因转染实验组和空白对照组2组，每组设48 h和72 h两个时间点，为保证实验的均衡性，同一时期的实验组与对照组分布在同一培养板中。实验共重复3次。

4.质粒转染：（1）瞬时转染系统效率的检测（荧光显微镜检测）：报告基因质粒pEGFP-N1与重组质粒按等比例共转染，48 h后于498 nm激发波长的荧光显微镜下观察绿色荧光的表达变化，优化与检测系统的转染效率；（2）MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染实验：6孔培养板中细胞密度接近（0.5 ～ 2）×105/ml（此时汇合率约为50﹪～ 60﹪）；37℃、5﹪CO2正常孵育细胞过夜，siRNA重组质粒DNA加入Opti-MEM培养液中，轻柔混匀，轻柔混匀Lipofectamine 2000，取5 μl稀释于Opti-MEM培养液中，轻柔混匀，室温孵育5 min，将质粒DNA与转染试剂混合，室温孵育20 min以便形成DNA-脂质体复合物，37℃、5﹪CO2孵育细胞48 ～ 72 h，其中转染24 h后可以给细胞更换培养液，于转染后48h与72 h检测。

5.检测指标：（1）实时定量PCR检测转染MuRFl基因后mRNA的表达变化：用超纯RNA提取试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取组织样本中总RNA（实验操作按产品说明书进行）；取5 μl RNA用1﹪琼脂糖凝胶进行电泳。用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒（CWbio. Co.Ltd，Cat#CW0744）进行反转录，PCR扩增（冰上操作），PCR软件分析扩增曲线和溶解度曲线并记录达到荧光阈值时的循环次数（cycle threshold，Ct值），采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析；（2）使用Western印迹灰度分析转染MuRFl基因后蛋白的表达变化：经过蛋白提取、蛋白定量、蛋白质电泳、蛋白质电转移、染色、封闭及与抗体（一抗：兔抗大鼠MuRF-1多克隆抗体1:100，二抗：山羊抗兔IgG1:4000，内参照：GAPDH）结合后用ECL化学发光法显色，之后用SBIO-RAD图像处理软件进行灰度分析，以各因子灰度与内参照灰度之比代表组织内MuRF-1蛋白的含量，以各灰度比与对照组灰度比的比值作为各蛋白因子的表达强度。

三、统计学分析方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后mRNA和蛋白质数据以± s表示。对照组与四组实验组的比较用单因素方差分析，多个样本均数的两两比较用LSD检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、转染效率的检测

培 养 的 大 鼠 成 肌 细 胞 系L6（图1），pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR与siRNA重组质粒按1:1共转染后48 h，荧光显微镜于498 nm激发波长下观察可见细胞中有大量明亮的绿色荧光，表明了转染系统有着较高的转染效率（图2）。

图1 倒置显微镜下观察大鼠成肌细胞 L6 生长情况(10 × 40)

图2 荧光显微镜下(498 nm)观察转染后大鼠成肌细胞L6

二、MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后mRNA表达变化

转染后48 h和72 h实时定量PCR分析结果（表1），干扰序列MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ、MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ对MuRFl基因mRNA的48 h抑制率分别为67﹪、31﹪、11﹪和20﹪，与对照组相比MuRFl-Ⅰ组有显著性差异（t = 3.922，P = 0.003）；其他三组序列间抑制效应与对照组无明显差异（P ＞ 0.05)；转染后72 h抑制率分别为79﹪、59﹪、50﹪和61﹪，不同干扰序列的抑制效果有差异（F = 19.088，P ＜ 0.001）；与48 h相比，抑制效应更为明显；以MuRFl-Ⅰ的抑制效果最为明显。

表1 MuRFl基因siRNA重组质粒转染48h、72h实时定量PCR结果（n = 3）

三、MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后蛋白表达变化

转染后48 h和72 h，Western印迹灰度分析结果（表2），各干扰序列MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ、MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ对MuRFl蛋白的48 h抑制率分别为61﹪、40﹪、9﹪和15﹪，MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ与对照组相比有显著性差异（tⅠ= 3.588，P = 0.005；tⅡ= 2.353,P = 0.04）；转染后72 h，显示各干扰序列MuRFl-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ对MuRFl蛋白的抑制率分别为70﹪、54﹪、30﹪、46﹪与48 h相比，MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效应更为明显，但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ与对照组相比仍无显著性差异（P ＞ 0.05）。4对序列中，以siRNA MuRFl-Ⅰ的抑制效果最为明显，蛋白水平的抑制效果与mRNA水平基本一致。

表2 MuRFl基因siRNA重组质粒转染48 h、72 h后Western印迹结果（n = 3）

讨 论

骨骼肌在失神经支配早期会出现快速萎缩，这一事实表明骨骼肌中蛋白代谢的动态平衡被打破了，蛋白降解占据了明显优势，而泛素-蛋白酶体蛋白水解途径中相关基因的表达上调、活性增强在此过程中发挥了至关重要的作用[3-4]，泛素连接酶E3可以分为：含HECT结构域（homologous to E6-AP C terminus）、RING结构域（ring fi nger domain）以及其他组分，是骨骼肌内蛋白质降解的主要途径，泛素蛋白酶体系中的关键酶，其决定了整个系统降解蛋白的特异性[5]。近来的研究发现[6-7]，在禁食、失神经支配、癌症、肾功能衰竭，糖皮质激素或细胞因子治疗等形成的肌肉萎缩模型中，肌肉萎缩盒F基因（muscle atrophy F-box，MAFbx）和MuRFl基因的转录产物显著升高。MAFbx编码的蛋白含有F-box结构域，此为E3泛素蛋白连接酶家族中SCF复合物（Skpl-Cull-Fbox）中的特征性结构。MuRF-l已被证实具有泛素蛋白连接酶活性，而此活性依赖于RING结构域的存在[7-8]。

Bodine等[9]通过评价肌肉湿质量的维持率，证明敲除MuRF-l基因的小鼠可以抵抗肌萎缩，在失神经后14 d，与对照组相比可以使失神经腓肠肌湿重少损失36﹪。近来的研究表明[10-11]，细胞活素类肿瘤坏死因子-a、蛋白水解诱导因子和血管紧张素Ⅱ等可通过活性氧簇的增加诱导核因子-κB的激活，导致蛋白酶体亚单位和泛素连接酶MuRF-l基因表达增加，肌蛋白降解。吴启平等[12]研究认为，MuRF-1可降解骨骼肌中的粗肌丝成分，使骨骼肌的蛋白松散而更易被降解，而细肌丝成分却可以得到较大程度的保存。结合上述国内外研究足以说明，MuRF-1在失神经骨骼肌萎缩中发挥着重要的作用，为从分子水平调控失神经后骨骼肌蛋白的高分解代谢，防止肌肉萎缩的发生提供了依据。

RNA干扰是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新技术，它通过导入一段与内源性靶基因同源的双链RNA序列，在转录水平关闭相应靶基因mRNA，使其相应蛋白表达缺失或下调的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默，已成为开展疾病基因治疗的新的方向。

在前期研究中[13-16]，动物实验证实在失神经后骨骼肌细胞中MuRF-1基因和蛋白在早期的高表达与失神经骨骼肌萎缩的发生密切相关，控制它们的表达可有效地延缓骨骼肌萎缩。在此基础上，本实验通过RNAi干扰技术，筛选出对MuRF-1基因有效的siRNA重组质粒，为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。针对目的基因不同位点所设计的siRNA序列在诱导RNAi的作用效力方面存在显著的差异，因此本实验设计4组干扰序列，以筛选出最优的干扰序列。siRNA重组质粒转染后，其抑制效应会在转染后几小时到几天出现，但部分研究显示出现在转染后48 ～ 72 h，因此本实验选用了48 h及72 h进行检测。针对MuRF-1构建的4个siRNA重组质粒，经mRNA和蛋白水平的检测证实siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果明显高于其他三组（P ＜ 0.05），且72 h抑制效果更明显。蛋白水平的变化幅度较转录水平低的原因可能为：（1）两种检测方法的敏感性不同有关，即westemblot远没有实时定量PCR敏感；（2）蛋白质的半衰期要远远长于mRNA[13]。

本研究中成功筛选出对MuRF-1基因有效的siRNA重组质粒，siRNA MuRF1-Ⅰ，为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础，从转录水平抑制某些特异性表达上调的基因或采用相关的蛋白酶体抑制剂，有望成为延缓肌肉萎缩新的、有效的途径。

1 Dehoux MJ, van-Beneden RP, Fernández-Celemín L, et al. Induction of MafBx and Murf ubiquitin ligase mRNAs in rat skeletal muscle after LPS injection[J]. FEBS Lett, 2003, 544(1-3):214-217.

2 Clavel S, Coldefy AS, Kurkdjian E, et al. Atrophy-related ubiquitin ligases, atrogin-1 and MuRF-1 are up-regulated in aged rat Tibialis Anterior muscle[J]. Mech Ageing Dev, 2006, 127(10):794-801.

3 de-Palma L, Marinelli M, Pavan M, et al. Ubiquitin ligases MuRF-1 and MAFbx in human skeletal muscle atrophy[J]. Joint Bone Spine, 2008,75 (1):53-57.

4 Attaix D, Ventadour S, Codran A. The ubiquitin-proteasome system and skeletal muscle wasting[J]. Essays Biochem, 2005, 41:173-186.

5 Cao PR, Kim HJ, Lecker SH. Ubiquitin-protein ligases in muscle wasting[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37(10):2088-2097.

6 Gomes MD, Lecker SH, Jagoe RT, et al. Atrogin-1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(25):14440-14445.

7 Foletta VC, White LJ, Larsen AE, et al. The role and regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF-1 in skeletal muscle atrophy[J]. P fl ugers Arch, 2011, 461(3):325-335.

8 Joazeiro CA, Weissman AM. RING finger proteins: mediators of ubiquitin ligase activity[J]. Cell, 2000, 102(5):549-552.

9 Bodine SC, Latres E, Baumhueter S, et al. Identification of ubiquitin ligasesreqrired for skeletal muscle atophy[J]. Science, 2001, 294(5547):1704-1708.

10 Russell ST, Wyke SM, Tisdale MJ. Mechanism of induction of muscle protein degradation by angiotensinⅡ[J]. Cell Signal, 2006, 18(7):1087-1096.

11 Moore-Carrasco R, Busquets S, Almendro V, et a1. The AP1/NF-kappa B double inhibitor SPl00030 can revert muscle wasting during experimental cancer eaehexia[J]. Int J Oncol, 2007, 30(5):1239-1245.

12 吴启平,梁炳生.经皮电刺激防治失神经骨骼肌萎缩机制研究[J].中华手外科杂志, 2010, 26(3):182-184.

13 王鹏飞,张登峰,粱炳生,等.大鼠失神经腓肠肌细胞内Fox03a及MuRF-1的表达规律[J].中华手外科杂志, 2012, 28(4):241-243.

14 李文斌,梁炳生,梁绪.核转录因子-κB与肌环状指蛋白1在失神经肌萎缩中的表达及意义[J].中华实验外科杂志, 2010, 27(4):538.

15 韩利军,梁炳生,王乐,等.失神经骨骼肌萎缩中泛素蛋白连接酶MuRF-1和核转录因子NF-κB表达与被动运动干预[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(24):4435-4438.

16 王乐,梁炳生,李文斌,等.失神经骨骼肌萎缩与氯沙坦通过核因子KB/MuRFl通路的延缓作用[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(15):2752-2755.

Silencing muscle RING finger protein 1 by RNAi in vitro

ZHU Zhi-xiang, LIANG Bing-sheng, FENG Yong, DA Zhi-feng, DING Jie, WEI Jian, JIA Ying-wei. Department of Orthopaedics (Micro and Hand Surgery), The 2nd Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

LIANG Bing-sheng, Email:liangbs707@yahoo.com

Objective To investigate the efficiency of RNAi technique in inhibiting MuRF-1 gene expression in rat muscle.MethodsFour siRNA recombinant plasmids were designed according to the rat MuRF-1 gene mRNA sequence (siRNA MuRF1-Ⅰ ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ) . Lipofactamine 2000 transfection reagent was used to transfect the plasmids into rat myoblasts L6 and MuRF-1 expression was evaluated after 48 h and 72 h respectively, using real-time quantitative PCR, Western blot amd immunoblot.Results(1) Real-time quantitative PCR showed plasmids MuRF1-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, and Ⅳ inhibited MuRF-1 mRNA by 67﹪, 31﹪, 11﹪, and 20﹪ respectively after 48 h, the inhibitory effects of the four plasimds were significant different(F = 4.527, P = 0.024); At 72 h, the inhibition rates were 79﹪, 59﹪, 50﹪and 61﹪ for the 4 plasimds and difference was significant among the 4 plasimds (F = 19.088, P ＜ 0.001)Compared with 48h, the inhibitory effect was greater at 72 h, especially for siRNA MuRF1-Ⅰ (t = 8.201, P ＜ 0.001 ). (2)Western blot analysis revealed the protein inhibition rates after transfection for 48h were 61﹪, 40﹪, 9﹪ and 15﹪ respectively The inhibitory effect of different plasmids was significantly different (F = 4.286, P = 0.028). At 72h, the inhibition rates were 70﹪ , 54﹪, 30﹪, and 46﹪, respectively (F = 3.731, P = 0.042). At 72 h, the inhibition was greater for MuRFl -Ⅰand MuRFl -Ⅱcompared to 48 h (tⅠ= 3.256, P = 0.009;tⅡ= 2.512, P = 0.03). MuRFl-Ⅲ and MuRFl-Ⅳ did not inhibit the gene expression as compared with the control group ( P ＞ 0.05 ). Among the four plasmids, the inhibitory effect of siRNA MuRF1-Ⅰ was greatest. The inhibitory effect on mRNA and protein levels were similar.Conclusion siRNA MuRF1-Ⅰ may be used for further study of gene function and gene therapy.

Muscle cell； L6； MuRF-1； Plasmid transfection； RNA interference

2013-01-19)

(本文编辑：蔡晓珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.005

国家自然科学青年基金（81000805）

030001太原，山西医科大学第二医院骨科（朱志祥、梁炳生、冯勇、达志峰、丁洁、韦建、贾英伟）；上海市第六人民医院骨科（冯勇）

梁炳生，Email：liangbs707@yahoo.com

朱志祥，梁炳生，冯勇，等.RNAi技术体外沉默肌肉环指蛋白1的研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志：电子版, 2013,