南海慢原甲藻的培养和毒性初探

刘俏，龙丽娟

摘要：研究了南海慢原甲藻（Prorocentrum rhathymum）在f/2、f、K、2K、ES、2ES培养基中的生长情况，并对其进行了小白鼠毒性、溶血活性以及腹泻性贝毒实验。结果表明，在温度25 ℃、盐度35‰、光照67.5 μmol/（m2·s）、起始密度500 cells/mL条件下，南海慢原甲藻在f培养基中生长最好，细胞密度最大，为7.2×104 cells/mL，生长率也最高，为0.647 division/d。南海慢原甲藻具有溶血活性，单位细胞溶血活性为4.8×10-7 HU/cell。胞内和胞外培养液均检测出腹泻性贝毒大田软海绵酸（OA），单位体积胞外OA含量为0.028 1～0.038 4 μg/mL，单位体积胞内OA含量稳定期最高，为1 690 pg/mL，单位细胞OA含量指数期最高，为29.0 fg/cell。

关键词：慢原甲藻（Prorocentrum rhathymum）；培养；生长；毒性

中图分类号：S968.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）05-1113-05

Cultivation and Toxicity of Prorocentrum rhathymum from South China Sea

LIU Qiaoa，b，LONG Li-juana

（a. South China Sea Institute of Oceanology / Key Laboratory of Marine Bio-Resourses Sustainable Utilization / Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica， Guangzhou 510301， China； b. University of Chinese Academy of Sciences， Chinese Academy of Sciences，

Beijing 100049， China）

Abstract： The growth of Prorocentrum rhathymum from South China Sea in f/2 medium， f medium， K medium， 2K medium， ES medium and 2ES medium was studied. The mouse toxicity test， hemolytic assay and DSP test were used to test the toxicity of P. rhathymum. The results showed that when temperature 25 ℃， salinity 35‰， illumination 67.5 μmol/（m2·s）， initial cell density 500 cells/mL， f medium was the best growth condiction for P. rhathymum. The cell density was 7.2×104 cells/mL and the growth rate was 0.647 division/d at those conditions. The hemolytic activity of P. rhathymum was 4.8×10-7 HU/cell. Both intracellular okadaic acid（OA） and extracellular OA in culture medium of P. rhathymum were detected. Extracellular OA content in per volume water was 0.028 1～0.038 4 μg/mL. The maximum intracellular OA content in per volume water was 1 690 pg/mL obtained in stationary phase. The maximum OA content in per cell was 29.0 fg/cell found in exponential phase.

Key words： Prorocentrum rhathymum； cultivation； growth； toxicity

慢原甲藻（Prorocentrum rhathymum）属于甲藻门（Pyrrophyta）纵裂甲藻纲（Desmophyceae）原甲藻目（Prorocentrales）原甲藻科（Prorocentraceae）原甲藻属（Prorocentrum Ehrenbeg），是一种具有底栖、附生、浮游三种生活方式的微藻，广泛分布于地中海[1-3]、太平洋[4-6]、大西洋的热带和亚热带水域[7]。有研究表明，慢原甲藻可导致牡蛎的消化道细胞脱落以及肠道变宽变薄[8]。2002年5月，澳大利亚新南威尔士的牡蛎大量死亡事件被认为与部分牡蛎摄食慢原甲藻有关[9]。

慢原甲藻的野生密度低、藻种难获得，因此关于慢原甲藻相关的研究性文献资料较少。中国科学院南海海洋研究所海洋活性物质及其化学生态学学科组从我国南海三亚海域分离纯化获得了慢原甲藻藻种，并在实验室成功进行人工培养，属国内首次记录[10]。国外已有报道慢原甲藻有小鼠急性毒性、溶血性和腹泻性贝毒[4，6]。国内南海慢原甲藻藻株是否含有毒性以及其生理生态等方面的研究尚属空白。本研究通过比较南海慢原甲藻在不同培养基中的生长情况，旨在获得适宜慢原甲藻生长的培养条件，并对其毒性进行检测，以期填补国内外对南海慢原甲藻研究的空白，为有效利用有毒甲藻资源提供科学的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

慢原甲藻采自南海三亚海域，由中国科学院南海海洋研究所海洋活性物质及其化学生态学学科组分离纯化得到藻种纯系，保存于中国科学院南海海洋研究所广东省海洋药物重点实验室藻种室。藻种保存条件为温度25 ℃、盐度35‰、光照94.5 μmol/（m2·s）、pH 8.0、光暗周期13 h∶11 h、培养基为f/2培养液。

1.2 实验方法

1.2.1 不同培养基对慢原甲藻生长的影响 研究f/2、f、K、2K、ES、2ES培养基对慢原甲藻生长的影响。实验条件为温度25 ℃、盐度35‰、光照67.5 μmol/（m2·s）、pH 8.0、光暗周期13 h∶11 h、起始密度500 cells/mL。f/2、K、ES培养基的配方参照文献[11-13]。f、2K、2ES培养基的营养盐浓度分别是f/2、K、ES培养基的2倍。

每天早上9∶00取样100 μL，加入1%甲醛固定。将藻液充分混匀后吸取10 μL于浮游植物计数框上，在显微镜下计数。每个样品重复计数3次，取其平均值，通过换算绘制生长曲线。

根据文献[14]的单细胞藻种群生长公式，计算得到藻细胞生长率K（division/d）。

K=■

式中，N0为藻细胞的初始密度（cells/mL），Nt为第t天（指数末期）的藻细胞密度（cells/mL），t表示培养时间（d）。

1.2.2 慢原甲藻胞内毒素与胞外毒素的提取 胞内毒素的提取：4 000 r/min离心15 min收集慢原甲藻细胞，弃上清后加甲醇，超声波振荡破碎15 min，4 000 r/min离心15 min收集藻提取液。重复上述步骤至藻提取液呈无色。在38 ℃下将藻提取液减压蒸干，4 ℃保存备用。

胞外毒素的提取：参考吴建欣[15]的方法，在已除去藻细胞的慢原甲藻培养液中加入37%盐酸，调节pH至3.0。将酸化处理的培养液置于分液漏斗中，加入二氯甲烷进行萃取。静置12 h后取下层溶液，38 ℃减压干燥。用二氯甲烷回溶后存于10 mL样品管中，吹干，4 ℃冷藏备用。

1.2.3 小白鼠毒性实验 采用1.2.2中提取胞内毒素的方法提取稳定期慢原甲藻的胞内毒素。用1%吐温60生理盐水稀释胞内毒素提取物，使其所含的细胞密度为1.0×106、2.0×106、4.0×106、8.0×106 cells/mL共4个浓度梯度。

将15只体重为（20±2） g的雌性昆明鼠（购于广东省实验动物中心）随机分成5组，每组3只。实验组小白鼠腹腔注射0.5 mL上述四种不同浓度的胞内毒素提取物，对照组注射0.5 mL 1%吐温60生理盐水，记录24 h内小白鼠的中毒症状与存活情况。

1.2.4 溶血实验 取兔血加入盛有等渗盐溶液（NaCl 73 mmol/L、柠檬酸钠42 mmol/L、葡萄糖114 mmol/L）的离心管中，1 000 r/min离心2 min，弃上清，重复3次后用等渗盐溶液将血细胞稀释成浓度为0.5%的兔血红细胞溶液。

洋地黄皂苷（Digitonin）作为溶血毒素的标准物，配制5.2 μg/mL的洋地黄皂苷水溶液。分别吸取洋地黄皂苷水溶液100、150、200、250、300 μL于5个试管中，并向每个试管中加入600 μL经处理的兔血红细胞溶液，用等渗盐溶液补足各体系至1 mL，使各试管中洋地黄皂苷的浓度分别为0.52、0.78、1.04、1.30、1.56 μg/mL。将上述标准反应体系为1 mL的混合溶液于37 ℃光照培养1 h，1 000 r/min离心2 min后取上清100 μL于96孔板，用Multiskan Ascent酶标仪测定波长450 nm下的溶血吸光度（A）。以洋地黄皂苷水溶液的终浓度为横坐标，溶血百分数为纵坐标绘制溶血活性的标准曲线。在标准反应体系中加入100 μL含200万个藻细胞的胞内毒素提取物进行溶血透光度测定，实验重复3次，阴性对照用等渗盐溶液处理，阳性对照用水溶液处理，藻细胞胞内毒素提取物的溶血百分数根据标准曲线可得到。

溶血百分数=（A样品-A阴性）/（A阳性-A阴性）×100%

式中，A样品为样品处理后的吸光度；A阴性为阴性对照的吸光度；A阳性为阳性对照的吸光度，各吸光度均在450 nm下测定。

1个溶血单位（HU）是在1 mL上述反应体系下使50%兔血红细胞溶血所需毒素的量。

1.2.5 腹泻性贝毒实验 分别收获指数期、稳定期、衰亡期的慢原甲藻50 mL，采用1.2.2中的毒素提取方法得到不同生长阶段的胞内毒素与胞外毒素的提取物。用美国Aabraxis公司的冈田酸检测试剂盒测定慢原甲藻胞内毒素与胞外毒素中的腹泻性贝毒大田软海绵酸（Okadaic acid，OA）。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对慢原甲藻生长的影响

慢原甲藻在f/2、f、K、2K、ES、2ES六种培养基中的生长情况如图1所示。慢原甲藻在K和2K培养基中的生长情况均不理想，在K培养基中的生长情况最差。慢原甲藻在2ES培养基中的细胞密度虽然比ES培养基中的大，但其生长率却比ES培养基中的小。慢原甲藻在f/2、ES、f培养基中的生长率相近。在f培养基中获得的细胞密度最大，为7.2×104 cells/mL，生长率也最大，为0.647 division/d。因此，6种培养基中f培养基最适宜慢原甲藻生长。

2.2 小白鼠毒性实验结果

在实验观察的24 h内，各实验组小白鼠均未死亡。小白鼠在注射含400万个藻细胞的胞内毒素提取物后0.5 h出现聚群、闭眼，但1 h后又恢复了活力。注射含200万、100万、50万个藻细胞的胞内毒素提取物的实验组小白鼠与对照组小白鼠相比，未出现明显的中毒症状。出现上述结果可能是由于注射剂量不够高或是南海慢原甲藻本身毒素含量较低，对小白鼠的毒性不强，导致高剂量组小白鼠的中毒反应不明显。

2.3 溶血活性实验结果

图2为溶血活性实验的标准曲线，标准曲线的回归方程为y=0.196 6 x+0.033 1（r2=0.982 5）。根据标准曲线的回归方程计算得到，当洋地黄皂苷浓度为1.07 μg/mL时可使兔血红细胞溶血50%，即1 HU相当于1.07 μg/mL的洋地黄皂苷。南海慢原甲藻含200万个藻细胞的胞内毒素提取物可使兔血红细胞溶血48.1%， 换算得单位细胞溶血活性为4.81×10-7 HU/cell。

2.4 腹泻性贝毒实验结果

图3为慢原甲藻指数期、稳定期、衰亡期的单位体积胞外OA含量和单位体积胞内OA含量。在不同生长阶段，慢原甲藻单位体积胞内OA含量为0.679 0～1.690 0 μg/mL，单位体积胞外OA含量为0.028 1～0.038 4 μg/mL，单位体积胞内OA含量是单位体积胞外OA含量的24～44倍。慢原甲藻各生长阶段单位体积胞外OA总量与单位体积胞内OA总量的变化趋势一致，两者OA含量均在稳定期最大，衰亡期最小。

慢原甲藻不同生长阶段的单位细胞OA含量与单位体积胞内OA含量如图4所示。由图4可知，慢原甲藻在指数期、稳定期、衰亡期的单位细胞OA含量存在差别，含量范围是21.3～29.0 fg/cell，指数期时含量最高，为29.0 fg/cell，由此推测OA的产生与细胞自身的生长繁殖活动有关。单位体积胞内OA含量与细胞密度呈正相关关系，因此在细胞密度最高的稳定期达到最大，此时单位体积胞内OA含量为1 690 pg/mL，且与指数期、衰亡期时的含量有显著差异。

3 小结与讨论

有研究报道，慢原甲藻可以在f/2、K、ES等培养基中生长[6，16，17]，但尚未有文献报道何种培养基更适合其生长。本研究结果表明，慢原甲藻在f培养基中不但生长率高达0.647 division/d，而且其细胞密度最大可达7.2×104 cells/mL，是文献记录的2倍[18]，说明通过培养基的优化选择可显著提高藻的产量。

不同地理品系的有毒甲藻藻株毒性差异较大。本研究所用的南海慢原甲藻与澳大利亚新南威尔士的慢原甲藻对小白鼠的毒性结果不同。新南威尔士株含180万个藻细胞的甲醇提取物能使实验鼠在20 min内死亡[8]，但南海株含400万个藻细胞的胞内毒素提取物对小白鼠也没有明显的毒性作用。说明南海慢原甲藻对小白鼠的毒性不强。本研究结果与日本冲绳岛的慢原甲藻实验结果相似[6，8]。

Nakajima等[6]研究表明慢原甲藻有溶血性，本研究与其结果相同。南海慢原甲藻的单位细胞溶血活性为4.81×10-7 HU/cell，比球形棕囊藻（Phaeocystis globosa）的溶血活性9.26×10-9 HU/cell高2个数量级[19]。南海克氏前沟藻（Amphidinium klebsii）稳定期粗提物的正丁醇部位溶血活性为3.14×10-7 HU/cell，乙酸乙酯部位的溶血活性为2.42×10-6～3.45×10-6 HU/cell[20]，表明藻提取液中不同极性部位的溶血活性大小可能不同，在以后的研究中可进一步探索慢原甲藻不同组分的溶血活性，以确认其溶血物质。

不同地理品系的同种藻其毒素含量存在差别。An等[21]在佛罗里达采集的五株慢原甲藻，只有一株被证明含有OA，说明并不是所有的慢原甲藻藻株都含有OA。Caillaud等[4]估计马来西亚的慢原甲藻单位细胞OA含量为2.9 fg/cell，是本研究慢原甲藻南海株单位细胞OA含量（21.3～29.0 fg/cell）的1/10。藻细胞胞内毒素含量与胞外毒素含量一般有显著差异。网状原角管藻（Protocetatium reticulatum）稳定期胞内毒素含量约是胞外毒素含量的2倍[22]。本研究中慢原甲藻单位体积胞内OA含量是胞外OA含量的24～44倍，说明慢原甲藻的腹泻性贝毒主要产于细胞内，很少分泌到胞外。慢原甲藻佛罗里达株的单位体积胞外OA含量为0.153 μg/L[21]，本研究中南海株单位体积胞外OA含量达28～38 μg/L。分析其原因，一方面可能是由于检测方法不同所致，本研究中OA含量测定采用的是试剂盒免疫检测法，而An等[21]的研究使用的是HPLC-荧光检测联用的化学检测法；另一方面也可能是由于本研究中的南海慢原甲藻腹泻性贝毒的毒性更强。

有毒微藻在不同生长时期的产毒情况存在差异。扁甲藻（Pyrodinium bahamense）和亚历山大藻（Alexandrium catenella）在指数期毒素含量最大[23，24]。微小原甲藻（Prorocentrum minimum）的毒性在衰亡期时最强[25]。微小亚历山大藻（Alexandrium minutum）单位细胞毒素含量在指数期最高，之后随时间的推移而减少，其单位细胞毒素含量的变化趋势与本研究结果一致[26]。塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）稳定期时的单位体积胞内毒素含量最高，与其细胞密度在稳定期达到最大有关[27]。慢原甲藻也在细胞密度最大时的稳定期获得最大的单位体积胞内OA含量，表明细胞密度是影响水体总毒性的重要因素之一。

对有毒甲藻的研究一直存在室内培养困难的问题，严重影响了对其进行全面系统深入的研究。本研究通过培养基的选择实验，明确了f培养基最适宜南海慢原甲藻生长，将室内培养记录的细胞密度提高了1倍，为进一步探讨慢原甲藻的培养条件获得了充足的研究材料。本研究确定了我国南海慢原甲藻藻株具有溶血活性和腹泻性贝毒，鉴于甲藻毒素存在结构新颖的物质，是潜在的新药开发资源，因此，在提高慢原甲藻产量的基础上，充分利用南海慢原甲藻的藻种资源，对其开展全面系统深入的毒素成分分析研究是今后慢原甲藻研究的重要方向。

参考文献：

[1] ALIGIZAKI K， NIKOLAIDIS G. Morphological identification of two tropical dinoflagellates of the genera Gambierdiscus and Sinophysis in the Mediterranean Sea[J]. Journal of Biological Research-Thessaloniki，2008，9：75-82.

[2] VILA M， MAS？魷 M. Phytoplankton functional groups and harmful algal species in anthropogenically impacted waters of the NW Mediterranean Sea[J]. Sci Mar，2005，69（1）：31-45.

[3] ANGL■S S， JORDI A， GARC？魪S E， et al. High-resolution spatio-temporal distribution of a coastal phytoplankton bloom using laser in situ scattering and transmissometry（LISST）[J]. Harmful Algae，2008，7（6）：808-816.

[4] CAILAUD A，IGLESIA DE LA P，CAMP？魪S M， et al. Evidence of okadaic acid production in a cultured strain of the marine dinoflagellate Prorocentrum rhathymum from Malaysia[J]. Toxicon，2010，55（2-3）：633-637.

[5] RICHLEN M L， LOBEL P S. Effects of depth， habitat， and water motion on the abundance and distribution of ciguatera dinoflagellates at Johnston Atoll， Pacific Ocean[J]. Mar Ecol Prog Ser，2011，421：51-66.

[6] NAKAJIMA I， OSHIMA Y， YASUMOTO T. Toxicity of benthic dinoflagellates in Okinawa[J]. Bull Jpn Soc Sci Fisheries，1981，47（8）：1029-1033.

[7] 林永水，周近明，何建宗.赤潮生物[M].北京：科学出版社，2001.

[8] PEARCE I， HANDLINGER J H， HALLEGRAEFF G M. Histopathology in Pacific oyster （Crassostrea gigas） spat caused by the dinoflagellate Prorocentrum rhathymum[J]. Harmful Algae，2005，4（1）：61-74.

[9] GRZEBYK D， SAKO Y， BERLAND B. Phylogenetic analysis of nine species of Prorocentrum（Dinophyceae） inferred from 18S ribosomal DNA sequences， morphological comparisons， and description of Prorocentrum Panamensis， sp. nov[J]. J Phycol，1998，34（6）：1055-1068.

[10] 梁计林，何伟宏，龙 超，等.慢原甲藻——南海热带附生甲藻新记录[J]. 热带亚热带植物学报，2011，19（1）：40-44.

[11] GUILLAND R R L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates[A]. SMITH W L， CHANLEY M H. Culture of Marine Invertebrate Animals[M]. New York： Plenum Press，1975.29-60.

[12] KELLER M D， SELVIN R C， CLAUS W， et al. Media for the culture of oceanic ultraplankton[J]. J Phycol，1987，23（4）：633-638.

[13] WEST J A，MCBRIDE D L. Long-term and diurnal carpospore discharge patterns in the Ceramiaceae， Rhodomelaceae and Delesseriaceae（Rhodophyta）[J].Hydrobiologia，1999，137：101-113.

[14] STEIN J R. Handbook of Phycological Methods：Culture Methods and Growth Measurements[M]. London：Cambridge University Press，1973.289-312.

[15] 吴建欣. 利玛原甲藻的黑海绵酸释放与提纯最佳化研究[D]. 台北：台湾大学，2007.

[16] ALIGIZAKI K， NIKOLAIDIS G， KATIKOU P， et al. Potentially toxic epiphytic Prorocentrum（Dinophyceae） species in Greek coastal waters[J]. Harmful Algae，2009，8（2）：299-311.

[17] PEREZ R， LIU L， LOPEZ J， et al. Diverse bacterial PKS sequence derived from okadaic acid-producing dinoflagellates[J]. Mar Drugs，2008，6（2）：164-179.

[18] 梁计林.三亚海域附生甲藻资源及Coolia monotis的培养与次生代谢产物研究[D].广州：中国科学院南海海洋研究所，2009.

[19] 商 文.球形棕囊藻对几种海洋生物的毒性效应研究[D]. 广州：暨南大学，2006.

[20] 龙 超.南海克氏前沟藻（Amphidinium klebsii）的培养及产毒研究[D]. 广州：中国科学院南海海洋研究所，2011.

[21] AN T， WINSHELL J， SCORZETTI G， et al. Identification of okadaic acid production in the marine dinoflagellate Prorocentrum rhathymum from Florida Bay[J].Toxicon，2010，55（2-3）：653-657.

[22] GUERRINI F， CIMINIELLO P， DELLAVERSANO C， et al. Influence of temperature， salinity and nutrient limitation on yessotoxin production and release by the dinoflagellate Protocetatium reticulatum in batch-cultures[J]. Harmful Algae，2007， 6（5）：707-717.

[23] GEDARIA A I， LUCKAS B， REINHARDT K， et al. Growth response and toxin concentration of cultured Pyrodinium bahamense var. compressum to varying salinity and temperature conditions[J]. Toxicon，2007，50（4）：518-529.

[24] NAVARRO J M， MU？譙OZ M G， CONTRERAS A M. Temperature as a factor regulating growth and toxin content in the dinoflagellate Alexandrium catenella[J]. Harmful algae，2006，5（6）：762-769.

[25] WIKFORS G H. A review and new analysis of trophic interactions between Prorocentrum minimum and clams，scallops， and oysters[J]. Harmful Algae，2005，4（3）：585-592.

[26] 邹迎麟，朱明远，HALL S.两种亚历山大藻产毒过程和毒素特征研究[J].黄渤海海洋，2001，19（3）：65-70.

[27] 陈 勇，刘洁生，罗 瑛，等.不同生长期的塔玛亚历山大藻破壁条件和产毒的初步研究[J]. 环境与健康杂志，2002，19（3）：175-178.