SIR方法研究真菌、细菌对森林土壤N2O贡献量的进展

章伟

摘 要：土壤硝化、反硝化是产生有害温室气体N2O主要的生物化学过程。除了原核细菌外还发现真核生物真菌（包括菌根真菌）也能参与土壤的硝化和反硝化过程并排放N2O。基质诱导抑制呼吸法（SIR）是目前研究真菌与细菌对N2O排放通量贡献的主要方法。该方法应注意以下几点：（1）诱导剂的选择应该根据不同土壤的理化性质选择，一般选择的诱导剂为葡萄糖，也有选择蛋白胨作为诱导剂。（2）预实验确定饱和诱导剂的量。（3）抑制剂应根据土壤理化性质进行选择，一般选择的抑制剂为放线菌酮和链霉素。（4）确定IAR，最大抑制率的时间。（5）真菌、细菌对N2O排放贡献量时间段的确定。

关键词：SIR；真菌；细菌；N2O；森林土壤

中图分类号 S15 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）05-19-02

空气中N2O气体的增加会导致全球变暖[1]，此外N2O也直接或间接破坏平流层中的臭氧[2]。有研究表明，来自土壤硝化和反硝化产生的N2O占全球大气N2O的90%。森林土壤又是N2O的重要排放源[3-4]，因此对森林土壤N2O排放机理的研究对估计和控制全球N2O的排放通量尤为重要。

土壤中硝化-反硝化作用是产生N2O的主要过程[6-7]。从目前认识的土壤N2O排放机理看，原核生物细菌一直被认为是土壤N2O产生的主要参与者[5-6]。但最近的研究表明，实际过程远比想像中的复杂，除了原核细菌外，还发现真核生物真菌（包括菌根真菌）也能参与土壤的硝化和反硝化过程并排放N2O[8]。细菌在完全厌氧条件下才能快速、完全地发生反硝化，相比之下真菌可以使用NO3-作为电子受体来进行呼吸作用和反硝化作用。许多真菌由于缺乏将N2O还原为N2的还原酶而使真菌的N2O产生数量和效率更高。如真菌P450nor催化NO还原的速度约为300μmol/min·kg，是细菌NO还原酶的5倍[9]。许多真菌能通过共同反硝化作用产生N2O，即通过结合从NO2-和其它氮化合物的氮原子产生杂合的N2O分子，但Baggs and Philippot[10]认为共同反硝化对土壤释放N2O的贡献即使到今天我们还有许多未知。目前这些研究主要集中在国外，国内还未见报道。

真核生物的内部代谢过程与原核生物有很大的不同，外部的影响因素（比如温度、O2分压、含水量、pH）也非常不同[11]。

Anderson和Domsch分别在1973、1975年利用基质诱导呼吸抑制方法（SIR）测量土壤微生物真菌和细菌的生物量。Anderson和Domsch发现土壤在加入葡萄糖后，由于土壤微生物增殖，土壤中CO2排放量在2～8h内可以保持一个稳定的高排放量。新的呼吸量可以一直持续到微生物群落增长的停滞阶段，在此期间呼吸量可以指示土壤生物量的多少。Anderson和Domsch在1975年通过添加细菌抑制剂（链霉素）和真菌抑制剂（放线菌酮）来测量细菌和真菌对土壤生物量呼吸的相对贡献量。

1 计算方法及数据处理

细菌与真菌生物量比例计算方法：

细菌生物量比例：（A-B）/（A-D）；

真菌生物量比例：（A-C）/（A-D）；

真菌细菌比率（FBR）：（A-C）/（A-B）；

抑制剂添加比率（IAR）：[（A-B）+（A-C）]/（A-D）。

其中，A为仅加入葡萄糖土壤的CO2呼吸量，B为加入葡萄糖和链霉素土壤的CO2呼吸量，C为加入葡萄糖和放线菌酮土壤的CO2呼吸量，D为加入葡萄糖链霉素及放线菌酮土壤的CO2呼吸量。IAR值接近于1说明基质诱导呼吸抑制法效果达到最佳。

2 讨论

添加诱导剂的量应使加入的量在1～10h时间段内土壤CO2呼吸量保持一个稳定排放量。抑制剂的量的确定方法应考虑以下2个方面：（1）单独加抑制剂使得土壤呼吸量达到最小；（2）同时加抑制剂使抑制剂添加比率IAR接近1。培养时间段至关重要，因为即使最佳的抑制效果下，长时间培养可能导致CO2排放量的浮动，因为活的微生物可能利用死的微生物可溶解物质作为能量或者营养源。FBR值的大小确定真菌、细菌2种菌体哪种是土壤的主要活性物质。Imberger和Velvi分别利用抑制剂方法测得FBR值在1.05～2.28。然而有的实验测定FBR变动很大，甚至出现负值，可能有以下几个原因：（1）一些抑制剂可能吸附了土壤成分，改变了抑制剂原有作用，造成抑制剂在培养阶段没有充分发挥作用。（2）一些抑制剂可能作为其他微生物能源物质被利用。（3）抑制剂抑制了某一微生物的生长，同时刺激另一微生物的生长。

放线菌酮呈中性，较少吸附于土壤颗粒，而链霉素呈碱性，可以强烈地吸附在土壤颗粒上，由于不同的土壤吸附能力不一样，所以在实际操作中必须预先确定每一种土壤的抗生素最合适的用量。由于抗生素可以吸附于土壤颗粒而失效，同时又可作为微生物的C源，所以在最合适用量范围内，尽可能加大用量，同时缩短培养时间。

土壤中真菌在微生物生物量占主要地位，真菌群落受到环境因素的影响（比如温度、O2分压、含水量、pH）很大[12]。因此，细菌与真菌的比值在不同土壤中变化很大。土壤反硝化是对土壤N2O排放贡献影响最大的过程之一，这个过程主要受到真菌和细菌活动的影响。在同时加入2种抑制剂土壤中也有N2O排放；可能有以下几种原因：（1）在加抑制剂的条件下培养，组成酶仍然具有活性；（2）在有抑制剂条件下，虽然新的酶不能合成，但是旧的酶降解速度很慢，还没有降解完成；（3）抑制剂可能成为非目标微生物的基质。

根据研究的分析结果可知，土壤中N2O主要产生于微生物的硝化和反硝化过程[12]，各个环节对土壤N2O排放的贡献量都是不一样的，且因土壤性质不同，差异较大。

3 展望

由于真菌在氧限制的一定条件下可以同时进行反硝化和氧气呼吸，所以在有氧条件下真菌产生的N2O比细菌产生得多。真菌广泛存在土壤和水中，所以真菌的存在对全球N2O预算起着很重要的作用。

根据研究，真菌对土壤N2O排放的影响是非常复杂的过程，目前还有许多问题需要解决：（1）菌根真菌在反硝化过程中所起的作用是将来研究的重点。由于目前的研究真菌对土壤N2O的排放的贡献的实验都是在短时间内进行的，但是在长时间的变化趋势还尚未清楚。（2）利用N15观察气体来源和去向，清晰地解释氮循环。（3）可以通过C13同位素追踪真菌碳在反硝化微生物群落的流向，进一步确定微生物对N2O的贡献量。（4）SIR方法的使用必须预先确定抑制剂的合适用量，抑制剂的用量是否与颗粒含量有关需进一步研究。（5）SIR方法与其他方法同时应用，以检查结果的准确性。

参考文献

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[12]续勇波，蔡祖聪.亚热带土壤氮素反硝化过程中N2O的排放和还原[J]. 环境科学学报，2008，28（4）：731-737. （责编：徐世红）