16S rRNA基因测序法鉴定猪多杀性巴氏杆菌的研究

丁晓

摘要：对66株猪多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明，PCR是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。应用能够扩增大多数原核生物16S rRNA基因的通用引物，对猪多杀性巴氏杆菌疫苗株（EO630）和野外分离株的16S基因rRNA进行PCR扩增，以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。

关键词：多杀性巴氏杆菌；16S rRNA；PCR

中图分类号：S852.61+2 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）05-0005-02

多杀性巴氏杆菌是一种广泛存在的感染致病菌，在我国规模化养殖场常有染病和发病。目前，在兽医临床上对该病的确诊仍普遍采用传统的病原分离方法，即通过对细菌进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴别，以确定细菌的种属和血清型。虽然这种方法能取得可靠的鉴定结果，但存在操作繁琐，耗时长等不足。近年来，唐先春等[1]建立了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法，对66株多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明，PCR检测是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。管宇等[2]成功地利用16S rRNA基因序列分析方法对禽多杀性巴氏杆菌的分离株及我国的代表性疫苗株进行了鉴定研究，结果表明2株分离菌与对照的强弱毒株之间的同源性为100%。

该试验应用能够扩增大多数原核生物16S rRNA基因的通用引物，对猪多杀性巴氏杆菌疫苗株（EO630）和野外分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增，以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。Premix-Taq酶和DNA Marker均为TaKaRa公司产品。

1.2 仪器

电热恒温培养箱、冰箱、无菌操作台、电泳仪及紫外分析仪、PCR仪。

1.3 培养基

血清肉汤：称取营养琼脂粉末33 g加入1 000 mL蒸馏水，加热溶解后分装高压灭菌（121 ℃，30 min）后，冷却到50～60 ℃，按3%的比例加入新生小牛血清，低温保藏备用。

血液琼脂平板：称取营养琼脂粉末33 g加入 1 000 mL蒸馏水，加热溶解后分装，高压灭菌（121 ℃，30 min）后，冷却到50～60 ℃，按5%～6%的比例加入无菌脱脂纤维兔鲜血，然后制成平板低温保藏备用。

麦康凯琼脂平板：称取麦康凯琼脂粉末33 g加入1 000 mL蒸馏水，加热至全部溶解，121 ℃高压灭菌30 min后，制成平板，低温保藏备用。

1.4 菌株来源

猪巴氏杆菌标准疫苗株（EO630），为广东省农科院兽医所提供。

猪巴氏杆菌野外分离株，为佛山科学技术学院传染病实验室提供。

1.5 基因组DNA的抽提

将血液琼脂培养基上的野外分离株用无菌生理盐水制成的细菌洗液和猪巴氏杆菌疫苗株，用UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒抽提细菌基因组DNA。操作步骤如下：

（1）取200 μL制备好的样品，加入400 μL Digestion Buffer混匀，再加入3 μL Proteinase K混匀，55 ℃保温5～10 min。

（2）加入200 μL无水乙醇混匀，然后用1 mL Tip 头将样品全部转移到套放于2 mL 收集管内的UNIQ-10柱中。

（3） 8 000 r/min室温离心1 min。

（4） 取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solition，10 000 r/min，室温离心30 s。

（5）重复步骤（4）一次。

（6）取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，10 000 r/min，室温离心15 s，以除去残留Wash Solution。

（7） 将柱放入新的洁净1.5 mL离心管中，在柱中央加入50 μL Elution Buffer，室温放置2 min。

（8）10 000 r/min，室温离心1 min。离心管中的液体即为基因组DNA。样品可以4 ℃或～20 ℃保存。

1.6 引物

使用能够扩增大多数原核生物16S rRNA 基因序列的通用引物，该引物同时能够扩增出猪附红细胞体和猫血巴尔通氏体的16S rRNA基因序列。引物由上海博亚公司合成。引物序列如下：

上游引物：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；

下游引物：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.7 PCR扩增

PCR反应在PCR仪上进行，反应体系的总体积为50 μL，其中Premix-Taq 酶25 μL，上、下游引物（50 pmol/μL）各1μL，模板为5 μL ，然后加dd H2O至50 μL 。扩增程序如下：94 ℃预变性10 min；94℃变性3 min，50 ℃退火1 min ，72 ℃延伸2 min ，32个循坏；最后72 ℃延伸7 min。阳性对照为链球菌疫苗株，以蒸馏水为阴性对照。其他反应程序同上。取10 μL PCR 产物，经溴化乙锭染色的10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射台上观察。

1.8 PCR产物的测序

将试验获得的两株猪巴氏杆菌PCR产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。

1.9 序列同源性分析

进入Internet登录美国国家生物技术信息中心（NCBI）站点后，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTn”程序，将序列与GenBank中已知的各种微生物序列进行相似性搜索，寻找同源核苷酸序列，确定其种类。采用DNAssist软件的多序列比对程序对试验获得的疫苗株和分离株的序列进行比较。

2 结果与分析

2.1 分离株的分离鉴定结果

分离株在麦康凯培养基上不生长，在鲜血琼脂培养基上生长良好，菌落形态均为露珠状、边缘整齐、有光泽的灰色圆形菌落，无溶血现象。在血清肉汤中培养，开始轻度浑浊，4～6 d后液体变清朗，管底出现粘稠沉淀，振摇后不分散，表面形成菌环。镜检观察形态一致，为球杆状或短杆状菌，两端钝圆、无鞭毛、不形成芽孢、两极着色、革兰氏染色阴性。

2.2 PCR扩增结果

从猪巴氏杆菌的分离株和疫苗株中抽提细菌基因组DNA，用通用引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，扩增出大小约为1.5 kb的DNA片段，以链球菌疫苗株为阳性对照的PCR扩增，也得到了相似的条带。以蒸馏水为阴性对照没有出现特异性条带。

2.3 PCR测序结果

经上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得猪巴氏杆菌疫苗株和野外分离株16S rRNA 基因核苷酸序列。

2.4 同源性分析

接入Internet进入美国国家生物技术信息中心（NCBI）站点，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTn”程序，将序列与GenBank中已知的各种微生物序列进行相似性搜索，寻找同源核苷酸序列，BLASTn结果显示，试验所获得的巴氏杆菌疫苗株和野外分离株的序列与GenBank中多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因序列同源性最高，达98%。用DNAssist软件的多序列比对程序试验获得的疫苗株和分离株的对试序列进行比较，结果显示，猪多杀性巴氏杆菌疫苗株（EO630）和野外分离株的16S rRNA基因的同源性为达97.5%。

3 小结与讨论

（1）多杀性巴氏杆菌野外分离株经常规培养、镜检、生化试验可以初步断定为多杀性巴氏杆菌，该试验对多杀性巴氏杆菌疫苗株和野外分离株用试剂盒抽提基因组DNA，按照试验使用的引物和PCR扩增系统进行目的片段的扩增，对扩增产物进行序列测定和分析，结果证明，试验建立的PCR扩增方法能成功地扩增出巴氏杆菌的16S rRNA基因，适合于进行多杀性巴氏杆菌的分子鉴定。

（2）多杀性巴氏杆菌是猪肺疫的病原菌。猪肺疫是一种危害严重的疾病，死亡率较高。该病主要引起成年猪的急性败血症，有时也可导致慢性呼吸道症状，致使猪群生长缓慢，严重影响经济效益。

rRNA按沉降系数分3种，分别为5S、16S和23S。16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，其基因序列由保守区和可变区组成，两者互相交错排列。编码rRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。现有细菌其祖先的某些痕迹仍留在其核苷酸序列中，这种痕迹为细菌的系统进化研究提供了可能。因此，有人将rRNA称为细菌的“化石”[3]。16S rRNA基因是目前最常被选用的分类鉴定基因，不同科、属、种间的细菌16Sr RNA基因同源性可达97%以上[4]。

管宇等[2]成功地利用16S rRNA基因序列分析方法对禽多杀性巴氏杆菌的分离株及我国的代表性疫苗株进行了鉴定研究，结果表明2株分离菌与对照的强弱毒株之间的同源性为100%。本试验只进行了2个猪多杀性巴氏杆菌株的16S rRNA基因的序列分析，虽然结果不能进一步揭示2株巴氏杆菌是否为同一个亚种，但从结果可以看出，猪多杀性巴氏杆菌疫苗株和野外分离株的16S rRNA基因的同源性为97.5%，说明猪多杀性巴氏杆菌疫苗株和野外分离株的16S rRNA基因存在一定差异。

（3）试验测定的猪多杀性巴氏杆菌疫苗株是目前广东猪群广泛使用的弱毒菌株，由于16S rRNA基因是一个具有高度保守性的基因，疫苗株和野外分离株之间16S rRNA基因序列的差异提示，疫苗株和野外流行的部分毒株之间的遗传特性存在着一定程度的差异，这种差异是否能解释猪多杀性巴氏杆菌疫苗免疫接种以后，在某些猪群仍然有猪肺疫病的散发，尚需要进行进一步的研究。

参考文献：

[1] 唐先春，吴 斌，陈焕春.猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及其应用[J].中国兽医科技，2004，34（2）：46-48.

[2] 管 宇，沈志强，刘吉山，等.应用16S rRNA基因测序法鉴定禽多杀性巴氏杆菌的研究[J].中国预防兽医学报，2003，25（5）：349-352.

[3] 腾懿群.16S rRNA基因对细菌感染的分子生物学研究[J].国外医学流行病学传染病学分册，1997，24（4）：60-63

[4] JONAS D，ROSENBAUM A，WEYRICH S，et al.Enzyme linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of Legionella in bronchoalveolar fluid[J]. J Clin Microbiol，1995，33（5）：1247-1257.