臭马比木茎段离体培养研究初报

2013-04-29陈剑锋李克克王承恩等

湖北农业科学 2013年7期

陈剑锋　李克克　王承恩等

摘要：以臭马比木（Nothapodytes nimmoniana）带芽茎段作外植体进行离体培养，研究了不同基本培养基和激素浓度对其侧芽萌发的影响。结果表明，基本培养基类型对臭马比木茎段外植体带芽茎段的萌发有极显著影响，以WPM作为基本培养基，侧芽萌发率和增殖系数极显著高于MS和B5培养基。正交试验结果显示WPM+0.5 mg/L TDZ+1.5 mg/L 6-BA最适于臭马比木茎段的离体培养，侧芽萌发率和增殖系数分别为96.8%和1.14。

关键词：臭马比木（Nothapodytes nimmoniana）；茎段；离体培养

中图分类号：S567.1+9；S339.4+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1692-03

臭马比木（Nothapodytes nimmoniana （Graham） Mablerley）又名青脆枝，属茶茱萸科假柴龙树属（Nothapodytes sp.）多年生植物，原产于我国台湾兰屿。臭马比木全株均含喜树碱，且含量远高于喜树，是提取抗癌药物喜树碱的优质原料[1]。喜树碱及其系列衍生物对胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等十多种癌症均有特殊疗效，已成为抗肿瘤药物的主要品种[2]。喜树碱需求量的不断增加导致喜树碱原材料资源面临枯竭的危险，臭马比木的野生资源也大幅减少，在一些国家已被列为敏感物种[3]。臭马比木以种子繁殖为主，产苗量低且成株时间长，远远不能满足市场的需求。因此，利用组织培养技术快速繁育臭马比木，并在培养过程中利用技术手段增加组培苗中的喜树碱含量，对合理有效利用资源、提供优质的喜树碱提取原料具有重要意义[4-6]。本研究以臭马比木的带芽茎段为外植体进行离体培养，初步建立离体快繁技术，旨在为臭马比木的快速繁殖、优良品种的保存及工厂化生产提供相关依据。

1 实验方法

1.1 臭马比木外植体的接种

实验用臭马比木材料取自仲恺农业工程学院钟村种质资源圃，为两年生植株，取健壮无病虫害枝条，洗净后剪取带有1～2个侧芽的茎段作为外植体，流水清洗1 h以上，用体积分数75%的乙醇表面灭菌10 s，无菌水漂洗2～3次后用1 g/L HgCl2溶液灭菌15 min，再用无菌水漂洗3～5次，将消毒后的茎段随机接种在培养基上，培养条件为温度（25±2）℃、光照度1 600 lx、光照时间16 h/d。

1.2 基本培养基对臭马比木侧芽萌发率和增殖系数的影响

分别以MS、WPM及B5为基本培养基，均添加7 g/L琼脂、30 g/L蔗糖、0.05 mg/L TDZ和0.1 mg/L 6-BA，pH 6.0，每处理接种50个外植体（带有70个侧芽），重复3次。接种30 d后统计外植体存活率、侧芽萌发率及增殖系数。

存活率=存活外植体个数/接种的外植体总数×100%

萌发率=萌发侧芽的外植体个数/存活的外植体个数×100%

增殖系数=萌发的侧芽个数/存活的外植体个数

1.3 正交试验

采用三因素三水平正交设计[7]考察基本培养基类型、TDZ浓度和6-BA浓度对外植体侧芽萌发率和增殖系数的影响，因素与水平见表1，正交试验每处理接种50个外植体（带有70个侧芽），30 d后统计侧芽萌发率和增殖系数。

2 结果与分析

2.1 培养基对臭马比木侧芽萌发的影响

分别以MS、WPM及B5为基本培养基，臭马比木带芽茎段外植体接种15～25 d后侧芽即开始萌动，30 d后各培养基中外植体存活及侧芽萌发的情况见表2。从表2可以看出，基本培养基类型对外植体存活率的影响不大，各处理差异不显著（P>0.05），但对茎段侧芽的萌发率和增殖系数有较大影响，WPM作基本培养基时侧芽萌发率和增殖系数均极显著高于MS和B5基本培养基（P<0.01），且芽苗健壮，长势良好（图1A）。MS作基本培养基时萌发的芽苗叶片薄而发黄，苗生长细弱，伸长不明显（图1B）；B5作基本培养基时侧芽萌动较慢，30 d时芽苗生长不明显（图1C）。且培养后期MS和B5培养基中均出现了不同程度的褐化现象。

2.2 正交试验结果

正交试验结果见表3。从表3可以看出，各因素中基本培养基类型对茎段侧芽萌发率和增殖系数的影响最大，其次是TDZ浓度，6-BA浓度对茎段离体培养的影响最小。方差分析表明，基本培养基类型对茎段侧芽萌发率和增殖系数的影响达极显著水平，TDZ浓度对茎段侧芽萌发率和增殖系数的影响达显著水平，6-BA浓度对茎段侧芽萌发率和增殖系数的影响不显著。最佳培养条件组合为A2B3C1，即以WPM为基本培养基，附加0.5 mg/L TDZ 和1.5 mg/L 6-BA，此条件下侧芽萌发率为96.8%，增殖系数为1.14，均高于其他正交试验组合的结果。取茎段外植体接种于该培养基中，侧芽萌发和生长情况见图2，可见芽苗生长健壮、长势良好。

3 小结与讨论

木本植物由于本身的特点，组织培养通常很难实现脱分化，本身易出现褐化、生根难、培养周期长等问题[8]，同时有研究发现木本植物的愈伤组织和胚状体的诱导较为困难，且许多研究结果不一致，难以形成定论[9]。以茎段为外植体进行组织培养，经短时间直接分化出芽是一条有效的快速繁殖途径[10]。组织培养的成功与否与培养基类型有很大关系，不同基本培养基中无机离子、有机营养物质含量各异，这些均是组织培养中外植体赖以生存和生长的基础[11]。臭马比木离体茎段组织培养过程中，培养基的类型和激素种类及配比是影响侧芽萌发和生长的关键因素。本实验对MS、B5、WPM 3种基本培养基进行了筛选，发现臭马比木离体茎段侧芽在WPM培养基中的萌发率远高于MS、B5培养基，这与红豆杉[12]、喜树[13]、银杏[14]等的研究结果一致。3种培养基中WPM培养基中的NH4+与NO3-浓度之比为1∶1，而MS和B5培养基中的NO3-浓度均高于NH4+。臭马比木离体茎段在MS、B5培养基中褐化明显，这是否与培养基中离子浓度和N源浓度高有关还需进一步研究[11]。

植物生长调节物质是培养基中的关键物质，虽用量极小，但在组织培养中起着重要的作用。基本培养基只能保证外植体的生存与最低的生理活动，只有加入适当的植物生长调节剂后才能诱导细胞分裂的启动、愈伤组织的形成以及根、芽的分化[15，16]。不同功能激素的配比是影响外植体成功启动的重要因子，组织培养中常用细胞分裂素和生长素的组合作为生长调节物质，但由于外植体本身内源激素水平的差异，在添加外源调节剂时要对外源调节剂的种类和浓度加以选择和优化。本实验在预实验过程中发现，6-BA与TDZ的组合更有利于臭马比木茎段侧芽的萌发，正交试验结果表明WPM+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ更适于臭马比木茎段侧芽的萌发。培养基的组成成分不同，对植物细胞的生长及次生代谢物的产生也有较大的影响，在实验优化的培养基中对臭马比木茎段进行离体培养，是否有利于臭马比木植株中喜树碱含量的提高还有待进一步的研究[17]。

参考文献：

[1] 王玲丽，刘文哲.不同种源喜树幼枝中喜树碱的含量[J]. 植物学通报，2005，22（5）：584-589.

[2] 李春杰，谷莹，韩应许，等. 喜树碱及其衍生物的研究进展[J]. 中国药物化学杂志，2003，13（5）：306-310.

[3] PADMANABHA B， CHANDRASHEKAR M， RAMESHA B， et al. Patterns of accumulation of camptothecin， an anti-cancer alkaloid in Nothapodytes nimmoniana Graham.， in the Western Ghats， India： Implications for identifying high-yielding sources of the alkaloid[J]. Current Science，2006，90（1）：95-100.

[4] 潘学武，董妍玲，董玉良，等.假柴龙树属植物资源的开发利用与喜树碱及类似物的生产综述[J]. 现代农业科技，2010（15）：242-243，248.

[5] 方力为.青脆枝快繁及抗癌有效成分分析[J].浙江林业科技，2008， 28（6）：47-49.

[6] 朱俐蒔.青脆枝及银杏药用植物增殖系统之建立[D].台湾台中：国立中兴大学，2009.

[7] 陈魁.实验设计与分析[M].第二版.北京：清华大学出版社，2005.

[8] 曹孜义，刘国民.实用植物组织培养技术教程[M]. 兰州：甘肃科学技术出版社，1999.

[9] 张红晓，经剑颖.木本植物组织培养技术研究进展[J].河南科技大学学报（农学版），2003，23（3）：66-69.

[10] 胡冬南，上官新晨，刘亮英，等.青钱柳茎段离体培养研究[J]. 湖北农业科学，2009，48（6）：1300-1303.

[11] 王博，范桂枝，詹亚光.不同培养基类型和植物生长调节剂配比对白桦愈伤组织中三萜积累的影响[J].林业科学，2008，44（10）：153-158.

[12] 金贞兰，刘继生，鲁京兰，等. 不同培养基对东北红豆杉愈伤组织诱导的影响[J].安徽农业科学，2010，38（19）：9993-9994. 9997.

[13] 杨国峥.喜树高效再生体系的建立与农杆菌介导的遗传转化研究[D].贵阳：贵州大学，2007.

[14] 周宏祈. 喜树组织培养与喜树碱诱导之研究[D].台北：国立台湾大学，2005.

[15] 朱大保.国外杨树组培微繁技术的进展[J].北京林业大学学报，1990，12（1）：84-91.