猪链球菌的分离与鉴定

庄晓薇

摘要：对16份猪场病猪病料进行病原菌分离、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验，结果表明，该病原菌为II 型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。

关键词：猪链球菌；分离；鉴定

中图分类号：S852.61+1 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）08-0013-03

猪链球菌 （Streptococcosis suis） 是引起猪的多种疾病的病原菌之一，该病原菌在养猪业发达国家如美、英、荷兰及爱尔兰等国常有发生。我国于 1958 年就有猪链球菌病的报道，1976 年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害[1]。

目前发现的猪链球菌荚膜型已超过 30 种。该病一年四季均可发生，但以 4～10 月份发生较多。常为地方性流行，多呈败血性，短期波及全群，如不进行防治，则发病率、病死率很高，慢性常为地方性散发性传染[2]。

1 猪场发病情况

2012 年 4 月，山东省临朐县某生猪繁育场仔猪流行关节炎及败血症，发病猪多为 2～6 周龄仔猪。无菌采取病猪的关节液、肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为II 型猪链球菌。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病料 无菌采取该生猪繁育场患关节炎病猪的关节液 8 份，分别编号为 1-8 号；无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结 8 份，分别编号为 9～16 号。

2.1.2 试剂 试验所用的各种糖均购自上海化学试剂二厂，批号为 2010～2012 年不等。

2.1.3 培养基 绵羊鲜血平板、匹克氏增菌液、10 ml/L猪血清肉汤及各种糖培养基按常规方法制备。

2.1.4 试验抗原 猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原均购自中国兽药鉴察所，批号为 990725。

2.1.5 药敏纸片 购自广东省某军区后勤部，批号 20000312。

2.1.6 试验动物 健康小白鼠 （30～35 g） 50 只，购自青岛农业大学动物科技学院。

2.2 方法

2.2.1 病原分离 将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后分别接种于鲜血琼脂平板。37 ℃ 需氧培养 24 h 后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37 ℃ 培养 24 h 后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种于血清肉汤，纯化后放置 4 ℃，冷藏备用[3]。

2.2.2 分离菌株的鑒定

（1）生化试验。随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物 3#、8#、13#、15#，分别接种于蔗糖、山梨醇、棉子糖、葡萄糖、水杨苷、马尿酸钠培养基，37 ℃培养24 h 后，观察其对糖的利用情况[4]。

（2）血清学鉴定。将 3#、8#、13#、15# 菌经血清肉汤培养 8 h，通过 3 000 r/min 离心 10 min，PBS 洗涤 2 次，用pH 7.2 的 0.01mol/L PBS制成 1：10～1：20倍稀释的细菌悬液。取 1 滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照[5]。

2.2.3 致病力及保护力试验

（1）菌落形成单位的测定。①将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒入已灭菌过的培养皿内，每皿约 15 mL 培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方，10 min 后，盖好皿盖。② 将培养皿倒置于 37 ℃ 培养 24 h 后，观察菌落情况，统计菌落数。③如果每个皿内菌落不超过 4 个，则可以认为无菌程度良好，菌落数很多，则应对无菌室进一步灭菌，再重复以上步骤。

（2）致病力试验。无菌吸取上述血清肉汤培养物（含菌量5.0×108 CFU/mL） 以0.1、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 mL/只分别腹腔注射小白鼠，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共 14 只，分 7 组。第一组每只小白鼠注射 3# 菌 0.2 mL，第二组每只注射 8# 菌0.2 mL，第三组每只注射 3#、8# 菌各0.1 mL，第四组每只注射 13# 菌 0.2 mL，第五组每只注射 15# 菌 0.2 mL，第六组每只注射13#、15# 菌各 0.1 mL，第七组每只注射无菌血清肉汤 1.0 mL作对照。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量[6]。

（3）保护力试验。将3#、8#、13#、15# 血清肉汤培养物分别接种于 18 cm 鲜血平板。37 °C 培养 24 h 后收菌。再用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用 0.3% 甲醛灭活，37 ℃ 作用 24 h后做无菌检验。然后将其分别腹部皮下接种小白鼠各 2 只，剂量为 0.4 mL/只。10 d后，再分别进行人工感染，剂量为 0.2 ml/只[7]。

（4）细菌回收试验。对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。

2.2.4 药敏试验 采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于 9 cm 鲜血平板；待稍微干燥后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4 ℃ 2 h使药物扩散，然后置 37 ℃培养 20～24 h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药[8]。

3 结果与分析

3.1 分离细菌的培养特性及形态特征

3.1.1 培养特性 37 ℃培养 24 h 后，所采集的12 份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的 β 溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

3.1.2 染色特性 关节液、鲜血琼脂血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列。

3.2 生化试验结果

表1结果表明分离的3#、8#、13#、15# 菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。

3.3 血清学鉴定结果

将 3#、8#、13#、15# 细菌悬液与 1/2 及 II 型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与 1 型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。

3.4 致病力及保护力试验结果

3.4.1 致病力试验结果 第一组、第二组小白鼠注射血清肉汤培养物 48 h 内均未见死亡，第三组 48 h 内有一只死亡，第四组、第五组、第六组在注射血清肉汤培养物 18 h 内全部死亡。死亡后，小白鼠皮肤发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。第七组健活。由于第一、二、三组小白鼠死亡数量较少，所以再用相同剂量分别背部皮下接种小白鼠各 2 只，48 h 后处死，剖检发现注射部位有直径 0.9～1.1 cm 的脓肿，浓汁呈黄绿色。

3.4.2 保护力试验结果 免疫的小白鼠再经攻毒后均未发病。

3.5 细菌回收试验结果

将上述死亡及发病的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离、生化试验及血清学鉴定，能得到原分离菌。

3.6 药敏试验结果

由表2可知，分离菌对头孢菌素、青霉素高度敏感；洁霉素和卡那霉素中度敏感；而对土霉素、链霉素、庆大霉素具有耐药性。

4 讨论

过去屡有败血型猪链球菌的报道，而关于集约化养猪场关节炎型链球菌病的报道较少。本次试验从患关节炎猪的关节液中成功分离出了猪链球菌。另外，该种猪场约有60% 的仔猪流行关节炎，严重者可发生败血症而死亡，给种猪场造成巨大的经济损失。所以，研究该病可为生产中防制该病提供理论依据。

病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体，建议首先应加强对健康猪的免疫。另一方面，在发病后对病猪和健康猪进行隔离，根据实验室药敏试验结果配合药物治疗，建议用头孢菌素、青霉素、洁霉素等药物治疗。该种猪繁育场采纳我们的建议，首先对所有的未发病仔猪用灭活疫苗免疫接种，对已发病的猪用青霉素等药物配合治疗，另外注意卫生管理。该病得到有效的控制。

5 结论

引起猪关节炎的猪链球菌的致病力较小，而引起败血症的猪链球菌的致病力较强。但通过生化试验和血清学鉴定，它们又是同种细菌且血清型也相同。同种血清型的猪链球菌的致病力之间的差异还有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 杨本升，刘玉斌，苟仕金，等. 动物微生物学[M]. 长春：吉林科学技术出版社，1995.

[2] 黄毓茂，黄引贤.2型猪链球菌的血清学鉴定[J].中国兽医学报，1995，15（1）：63-65

[3] 李健强，李大金.兽医微生物学实验实习指导[M]. 西安：陕西科学技术出刊社，1999.

[4] 张彦明，贾靖国，刘安典.动物性食品卫生检验技术[M]. 西安.西北大学出版社，1996.

[5] 蔡宝祥.家畜传染病学[M]. 北京：中国农业出版社，1998.

[6] 甘肃农业大学.兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，1982.

[7] 刘荣标.兽医微生物学（上）[M]. 台北：艺轩图书出版社，1984.

[8] 郑明球.家畜传染病学实验指导[M]. 北京：中国农业出版社，1999.