抗生素对辣椒外植体愈伤组织诱导的影响

2013-04-29金典生魏理张庆琛

湖北农业科学 2013年9期

金典生　魏理　张庆琛

摘要：以辣椒（Capsicun annuum L.）子叶和下胚轴为外植体，考察卡那霉素和羧苄青霉素对辣椒愈伤组织诱导和不定芽分化的影响。结果表明，随着培养基中抗生素浓度的提高，辣椒外植体愈伤组织的诱导率逐渐降低，褐化率升高。和卡那霉素相比，羧苄青霉素的影响稍弱，其浓度为500 mg/L时外植体愈伤组织诱导情况仍较好。此外，与下胚轴相比，子叶分化形成不定芽的频率更高。

关键词：辣椒（Capsicun annuum L.）；外植体；愈伤组织；抗生素

中图分类号：S641.3；S339.4+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2185-03

辣椒（Capsicun annuum L.），又名番椒、海椒、青椒、椒子、秦椒等，属双子叶植物纲茄目茄科辣椒属植物。辣椒含有人体必需的碳水化合物、蛋白质以及各种维生素等，具有很高的营养价值，一直深受人们的喜爱，在世界各地广泛栽培[1]。多年来一直困扰辣椒生产的一个主要问题是其容易受病菌的侵染，导致产量和品质大大降低。通过常规的育种手段从现有品种中筛选出高抗、优质的品种难度大、耗时长，而且会造成作物遗传多样性的下降和有益基因的流失[2]。生物技术的快速发展，特别是基因工程的迅速兴起，使人们能定向地将一些抗病虫害的基因导入农作物，改良物种[3]，转基因技术在辣椒品种培育中的应用得到了飞速发展，其中应用最广泛的是根癌农杆菌介导法，它具有转化方法简单、效率高和拷贝数少等优点，因而倍受人们关注[4]。在农杆菌介导的遗传转化中，筛选培养基中往往要添加抗生素用于抑制农杆菌和作为抗性选择标记。由于不同种类的抗生素对农杆菌菌株的抑制效果不同，不同作物的外植体对抗生素的反应也存在差异，而且有的抗生素在使用中表现出植物激素类似物的效应，影响植物组织的生长和分化[5]。所以，在辣椒进行基因转化之前，研究抗生素对辣椒愈伤组织诱导和生长的影响，确定合适的抗生素及适宜的浓度，对于更好地从事辣椒转基因研究至关重要。本研究选用了卡那霉素（Kanamycin）和羧苄青霉素（Carbenicilin）2种抗生素，探讨其对辣椒愈伤组织诱导和生长的影响，以期为提高辣椒基因转化效率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

辣椒种子购自北京中良信农业技术开发有限公司。卡那霉素和羧苄青霉素均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 辣椒无菌苗的获得选取新鲜饱满的辣椒种子经灭菌水浸泡10 min，70%（体积分数）的乙醇消毒30 s，灭菌水漂洗3次（2～3 min/次），0.1 g/mL的次氯酸钠浸泡15 min，灭菌水漂洗5～6次（2～3 min/次），转入无菌的培养皿滤纸上将水分吸干[6]。取经无菌处理过的辣椒种子，在超净工作台上将其转入经高温灭菌过的种子培养基上，每瓶培养基约10粒种子，然后于25 ℃、光照条件下培养14 d左右至两片子叶完全展开而未长出真叶[7]。

1.2.2 不定芽的诱导及继代培养取无菌培养的辣椒幼苗，在超净工作台上将其子叶切成0.5 cm×0.5 cm的片状，下胚轴剪切成长0.5 cm左右的小段，分别接种于筛选培养基上，在25 ℃、光照条件下培养，3周后观察其愈伤组织诱导率和褐化率。

1.2.3 培养基 ①种子培养基。MS+3%蔗糖+0.7%琼脂（pH 5.8～6.0）。②诱导培养基。MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%琼脂（pH 5.8～6.0）。③筛选培养基。MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%琼脂（pH 5.8～6.0），附加不同浓度的卡那霉素（0、10、20、30、50 mg/L）或羧苄青霉素（0、200、300、400、500 mg/L）。④伸长培养基。MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3+3%蔗糖+0.7%琼脂（pH 5.8～6.0）。

2 结果与分析

2.1 不同抗生素及浓度对辣椒愈伤组织诱导的影响

以辣椒无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，接种于含不同浓度抗生素的培养基中诱导愈伤组织，3周后统计愈伤组织诱导率和外植体褐化率，结果见表1。由表1可知，在没有添加任何抗生素的对照培养基中，愈伤组织诱导率达到92.00%以上。愈伤组织诱导率随着培养基中抗生素羧苄青霉素和卡那霉素浓度的升高而下降，并且出现褐化现象。羧苄青霉素对愈伤组织诱导的影响较小，其在培养基中的浓度升高到500 mg/L时辣椒外植体的愈伤组织诱导率仍较高，达到84.00%，且褐化率较低，仅为4.00%。而卡那霉素对愈伤组织的诱导有较强的抑制作用，诱导率随其浓度的升高迅速下降，卡那霉素浓度仅为10 mg/L时诱导率即下降至75.00%，褐化率则随其浓度的升高不断升高，卡那霉素浓度为50 mg/L时褐化率高达28.57%。

2.2 外植体类型对愈伤组织诱导和不定芽分化的影响

本实验取两周左右苗龄的辣椒子叶和下胚轴作为外植体来诱导愈伤组织。实验过程中发现同等培养条件下，下胚轴经愈伤组织诱导长出不定芽，而子叶可直接诱导出不定芽（图1）。

3 讨论

在农杆菌介导的遗传转化过程中，要加入一定量的抗生素来抑制农杆菌的生长和作为抗性选择标记，但是抗生素对农杆菌抑制的同时对植物组织的生长也有一定的影响，为减轻或消除这种影响，进行抗生素种类和浓度筛选的研究是必要的[8]。本實验用辣椒无菌苗的子叶和下胚轴作为外植体，研究不同浓度羧苄青霉素和卡那霉素对辣椒愈伤组织诱导和生长的影响。结果表明，卡那霉素对辣椒外植体愈伤组织的生长产生抑制作用，并且抑制作用随着卡那霉素浓度的升高而增强。相对而言羧苄青霉素对辣椒愈伤组织诱导的影响较小，且较低浓度的羧苄青霉素对辣椒愈伤组织的生长具有一定的促进作用，与张明洲等[9]的报道相似。

辣椒愈伤组织的诱导培养是辣椒离体组织培养体系中的关键环节，选择合适的外植体对获得优良的胚性愈伤组织及建立高效的离体再生体系至关重要。目前已有从辣椒子叶[10]、叶柄[11]、茎尖[12]、下胚轴[10]等各种外植体诱导出愈伤组织并形成再生植株的报道。本实验采用辣椒无菌苗子叶和下胚轴作为外植体进行愈伤组织的诱导，结果表明在同等条件下下胚轴的出愈率较快，但子叶长出不定芽的频率要比下胚轴高得多，这和朱昌叁等[13]、陈静娴等[14]的实验结果相似，所以首选子叶作为辣椒组织培养的外植体。

本实验在辣椒不定芽长到一定程度后将其转接到伸长培养基上，进行不定芽的伸长培养，发现和愈伤组织诱导阶段相比，不定芽的长度伸长了，但是生长状态并不理想，短期内不能达到生根移栽的程度。有研究表明，基因型、苗龄、外植体、培养基、培养条件等都会对辣椒再生体系的建立产生一定的影响[10]，如何进一步优化培养条件，促进辣椒不定芽的生长成苗还有待进一步研究。在进行组织培养时，很容易受到污染、褐化等影响导致实验失败，因此，實验要严格在无菌条件下进行操作，控制温度和培养基成分，并及时继代培养，从而尽可能地降低褐化率。

参考文献：

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