石榴F3’H基因PCR反应体系的研究

陶吉寒　招雪晴等

摘要：从石榴（Punica granatum L.）泰山红品种的花瓣中提取总RNA并反转录得到cDNA。设计简并引物对石榴类黄酮3-羟化酶（F3H）基因进行PCR扩增，筛选合适的引物及退火温度。结果表明，适合石榴F3H基因扩增的正反向引物分别为5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCDGCWATGGCCCAHAYRTT-3′。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃保温10 min。

关键词：石榴（Punica granatum L.）；F3H基因；PCR

中图分类号：S685.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2168-03

石榴（Punica granatum L.）为石榴科落叶灌木或小乔木，在中国已有两千多年的栽培历史，在长期的自然选择和人工栽培过程中形成了丰富的遗传多样性[1，2]。石榴不仅是人们喜爱的传统水果，也是一种优良的园林绿化树种。石榴花朵艳丽，其花瓣有单瓣、复瓣、重瓣、台阁等不同花型，红、粉红、白、黄等不同花色[3]，观赏价值极高。目前对石榴AFLP[1，2]、ISSR[4]、RAPD[5]、SARP[6]等分子标记的研究较多，而对控制石榴花色形成相关基因的报道较少。类黄酮3-羟化酶（F3H）属于细胞色素P450单加氧酶家族，在花色苷生物合成途径中发挥重要作用，具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能[7]，可将4，5，7-三羟基黄烷酮（Naringenin）和二氢堪非醇（Dihydrokaempferol， DHK）分别转化成圣草酚（Eriodictyol）和二氢栎精（Dihydroquercetin，DHQ）后形成不同颜色的花色苷，使植物表现出不同的花色[8]，克隆F3H基因可为研究石榴的花色形成提供分子基础。本研究以石榴泰山红品种的花瓣为材料，对F3H基因的PCR擴增条件进行优化，从而建立高效特异的石榴F3H基因PCR扩增体系，为后续石榴花色形成机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

于2012年5～6月从山东省果树研究所石榴种质资源圃采集泰山红石榴的花瓣，放入液氮速冻后放入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取结果

2.2 引物对的筛选

2.3 退火温度的优化

3 讨论

PCR是基因分离、克隆和核酸序列分析等分子生物学研究的基础，影响PCR产物特异性和得率的因素很多[9]，如退火温度、退火和延伸时间、引物和酶的浓度、Mg2+的浓度等，所以对不同的基因来说，应根据实际情况对PCR条件进行优化。

目前石榴F3H基因序列还没有报道，因而无法获得该基因的特异引物。简并PCR技术利用引物序列的6个简并性碱基，扩增位点多，没有物种特异性，与DNA的复杂程度无关[10]。本研究以GenBank中登录的其他物种的F3H基因保守区域的核苷酸序列为参考，设计不同的简并引物进行PCR扩增，由于引物的简并性，使得扩增的特异性有所降低，因而必须对使用的引物进行筛选，以获得最佳扩增引物。

在PCR扩增过程中，退火温度取决于引物长度、序列、碱基组成和引物的浓度[11]。较高的退火温度会使模板复性的准确性提高，从而提高扩增的特异性，但是温度过高会使得引物与模板亲和力变小，以致不能结合，得不到扩增产物；而温度过低又有可能出现非特异性扩增。另外，由于理论预测与实验差别较大，所以不同的引物适宜的退火温度不同，在PCR扩增时有必要进行最佳退火温度的确定。

本研究在对PCR引物进行筛选时，发现F1R2和F2R2这两对引物均能扩增得到目的片段，其中F1R2引物在50 ℃的退火温度下的PCR扩增产物具有特异性，但产量很低，不利于后续实验的进行。而F2R2引物在50 ℃的退火温度下有非特异性扩增产物，通过提高退火温度减少非特异性扩增，取得了较好的扩增效果。实验结果表明，适合石榴花瓣F3H基因PCR扩增的正反向引物分别为5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCD

GCWATGGCCCAHAYRTT-3′，PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃保温10 min。

参考文献：

[1] 苑兆和，尹燕雷，朱丽琴，等.山东石榴品种遗传多样性与亲缘关系的荧光AFLP分析[J]. 园艺学报，2008，35（1）：107-112.

[2] YUAN Z， YIN Y， QU J， et al. Population genetic diversity in Chinese pomegranate （Punica granatum L.） cultivars revealed by fluorescent-AFLP markers[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2007，34（12）：1061-1071.

[3] 汪小飞，周耘峰，黄 埔，等.石榴品种数量分类研究[J]. 中国农业科学，2010，43（5）：1093-1098.

[4] 赵丽华，李名扬，王先磊，等. 石榴种质资源遗传多样性及亲缘关系的ISSR分析[J]. 果树学报，2011，28（1）：66-71.

[5] 张四普.石榴优异资源的调查收集和RAPD鉴定方法的研究[D].郑州：河南农业大学，2004.

[6] 张四普，汪良驹，曹尚银，等.23个石榴基因型遗传多样性的SRAP分析[J].果树学报，2008，25（5）：655-660.

[7] WERCK-REICHHART D，FEYEREISEN R. Cytochromes P450： A success story[J]. Genome Biol，2000，1（6）：1-9.

[8] DOOSTDAR H， SHAPIRO J P， NIEDZ R， et al. A cytochrome P450 mediated naringenin 3′-hydroxylase from sweet orange cell cultures[J]. Plant and Cell Physiology，1995，36（1）：69-77.

[9] INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M]. UT， Salt Lake City： Academic Press，1990.

[10] 张伟伟，张衍梅，赵 刚，等. DOP-PCR阴性对照中的产物分析及引物浓度的优化[J]. 武汉大学学报（理学版），2006，52（2）：220-224

[11] SAIKI R K. The design and optimization of the PCR[A]. ERLICH H A. PCR Technology： Principles and Applications for DNA Amplification[M]. New York： Stockton Press，1989.