基于ITS序列对万寿菊叶斑病病原菌的分子鉴定

高山　王孟飞等

摘要：采用改良的CTAB法提取万寿菊（Tagetes erecta L.）叶斑病病原菌总DNA，以ITS1和ITS4为引物扩增病原菌的ITS片段，PCR扩增产物纯化后测序并与数据库中的已知序列进行BLAST比对，构建分子系统发育树，对该病原菌进行分子鉴定。结果显示分离的万寿菊叶斑病病原菌ITS序列与GenBank中万寿菊链格孢（Alternaria tagetica）AF267134的ITS序列相似度为99%，在分子系统发育树上与万寿菊链格孢菌株聚为一支，结合形态特征确定分离的万寿菊叶斑病病原菌为万寿菊链格孢。

关键词：万寿菊（Tagetes erecta L.）；叶斑病；ITS；链格孢属（Alternaria）；鉴定

中图分类号：Q939；S432.4+2；S436.8；S682.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2074-03

万寿菊（Tagetes erecta L.）为菊科（Compusitae）万寿菊属（Tagetes）一年生草本植物，不仅可用于城市的园林美化，同时也是理想的提纯天然黄色素的原料。湖北省恩施土家族苗族自治州为发展当地经济、加速新农村建设进程，积极建设万寿菊种植基地，努力扩大种植面积，巴东、鹤峰、咸丰、来凤等地的万寿菊种植已形成一定规模。但万寿菊易受到叶斑病的危害，发病率轻时占20%～30%，重则达70%以上，而且危害周期长、影响范围广，难以防治，使万寿菊的产量和质量严重下降[1]，对万寿菊的规模化生产造成了严重的威胁。

目前对万寿菊叶斑病原菌的鉴定多采用传统分类鉴定方法，因形态、地域的差异，结论并不一致。如高洁等[1]通过形态学、生理生化性状及生态学特征将万寿菊细菌性叶斑病的致病菌确定为丁香假单胞菌万寿菊致病变种（Pseudomonas syringae pv. tagetis）；王龙等[2]则将甘肃地区万寿菊叶斑病的病原鉴定为链格孢属（Alternaria sp.）物种。王婷等[3]通过形态鉴定将万寿菊叶斑病的病原菌鉴定为细极链格孢（A. tenuissima）。与传统的形态学鉴定方法相比，分子标记技术快速稳定，且不易受环境等因素的影响。ITS序列是核糖体DNA上的转录单位间隔区（Internal transcribed spacer，ITS），进化中由于不加入成熟核糖体，承受的选择压力较小，进化相对迅速且具有广泛的序列多态性，在其保守性上表现为在种内不同菌株间高度保守，而在种间存在明显差异，这为真菌的分类鉴定和分子检测提供了丰富的遗传信息，有利于属内种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[4]。本研究采用ITS分子标记结合形态学分类法对万寿菊叶斑病进行鉴定，以期为万寿菊叶斑病的有效防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

万寿菊叶斑病带病植株采自湖北省恩施土家族苗族自治州巴东县；病原菌菌株分离后保存于恩施职业技术学院生物工程系微生物实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 万寿菊叶斑病病原菌总DNA的提取及检测 采用改良的CTAB法[5]提取万寿菊叶斑病病原菌的DNA，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA样品的质量。

1.2.3 万寿菊叶斑病病原菌ITS序列测定 万寿菊叶斑病病原菌ITS-PCR扩增产物采用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司武汉测序部测序，测序要求为单向、正向测序，2个重复。

1.2.4 万寿菊叶斑病病原菌ITS序列分析与分子系统树的构建 将测序结果结合Chromas软件查看峰形进行纠错，所得序列在GenBank中进行BLAST同源性比对，同时在NCBI中下载同源序列。根据我国菊科植物上发现的链格孢属物种[6]以及与链格孢属形态相似的属[7]选择下载序列，共下载ITS序列16条。所有序列采用ClustalX 1.83软件进行多序列比对，应用MEGA 4.0软件采用邻接法（N-J法）构建系统发育树，其他参数默认，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为外类群。

2 结果与分析

2.1 万寿菊叶斑病病原菌ITS-PCR扩增产物的电泳检测结果

结合形态观察，万寿菊叶斑病病原菌菌株培养后可产生分生孢子，呈倒棒状、具长喙，孢子基本呈链状分布，患病植株叶片上的病斑开始时近圆形或长圆形，褐色，直径为1～5 mm，后变深褐色至近黑色，常相互愈合致整叶枯死，亦为害小枝和花茎，使病株矮化，或侵染花部使整朵花变黑褐色，与万寿菊链格孢的形态学特征一致，从而可确定本研究分离的万寿菊叶斑病病原菌为万寿菊链格孢。

3 小结与讨论

植物病原菌种类繁多，形态复杂且易受环境的影响，对这些病原菌的鉴定如果仅从形态学和生理生化特征来进行，有一定的局限性。分子鉴定具有快速、简便、分辨率高等特点，并可进行多相分类，按照种系进化的关系确定精确的位置和定种，可使分类鉴定结果更加客观合理[10]。基于ITS序列的分子标记技术灵敏、快速、準确[11，12]。本研究通过ITS序列分子鉴定，结合形态观察确定分离的万寿菊叶斑病病原菌为万寿菊链格孢，为万寿菊叶斑病的综合防治和万寿菊种植业的发展提供了科学依据。

参考文献：

[1] 高 洁，白庆荣，董 然，等.万寿菊细菌性叶斑病的发生与病原菌鉴定[J].吉林农业大学学报，2002，24（2）：94-96.

[2] 王 龙，张霄凌，何冬云，等.万寿菊叶斑病的发生及病原鉴定[J].南方农业（园林花卉版），2007（2）：7-9.

[3] 王 婷，王 龙，王生荣.万寿菊叶斑病病原鉴定及其生物学特性研究[J].甘肃农业大学学报，2010，45（3）：66-68.

[4] 仇 萌，邹先彪.rDNA-ITS序列鉴定深部真菌菌种的研究进展[J].中国真菌学杂志， 2011，6（2）：122-125

[5] HILLIS D M， MORITZ C， MABLE B K， et al. Molecular Systematics[M]. MA Sunderland： Sinauer Associates，1996.

[6] 张天宇. 中国菊科植物上链格孢属真菌的种[J]. 云南农业大学学报，2002，17（4）：320-324.

[7] 沈瑞清，康萍芝，张丽荣. 链格孢属（Alternaria Nees）与形态相似属区别的研究进展[J]. 宁夏农林科技，2004（6）：60-61.

[8] 许忠能. 生物信息学[M]. 北京：清华大学出版社，2008.

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[11] 和晓娜，李书兰，李安利，等.基于ITS序列对秦岭4种未知真菌进行分子鉴定[J].安徽农业科学，2012，40（3）：1271-1271.

[12] 高 磊，徐 彪，何 刚，等.基于ITS区序列的疑似野生双孢菇菌株的分子鉴定[J].江苏农业科学，2012，40（4）：31-33.