与番茄抗叶霉病基因Cf—16连锁的分子标记筛选及种质资源鉴定

李宁　姚明华等

摘要：以携带抗叶霉病基因Cf-16的番茄（Lycopersicon esculentum）材料Ontario 7816为母本，感病材料07880为父本配置杂交，以亲本及其F2代分离群体为研究材料，采用SSR和AFLP技术筛选与抗叶霉病基因Cf-16连锁的分子标记。结果表明，鉴定到与Cf-16基因连锁的SSR标记1个、AFLP标记5个，并将AFLP标记E-ACA/M-TCG219转化为AFLP-SCAR标记并应用于种质资源筛选，筛选出3份携带Cf-16基因的番茄材料，为抗叶霉病育种提供了基础。

关键词：番茄（Lycopersicon esculentum）；叶霉病；Cf-16基因；SSR标记；AFLP-SCAR标记

中图分类号：S641.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2066-04

叶霉病是由褐孢霉属（Fulvia）褐孢霉[Fulvia fulva （Cooke） Cif.]引起的番茄（Lycopersicon esculentum）主要病害之一，既影响番茄产量又影响果实品质，从而造成经济损失[1]。选育和推广抗病品种是解决番茄叶霉病最为经济、有效和环保的途径之一。但是防治番茄叶霉病是十分困难的，主要是由于番茄叶霉病病原菌的生理小种分化十分迅速，育成含有新的Cf抗病基因的栽培品种不久后，就会分化出侵染该基因的新致病生理小种。目前，国内番茄抗叶霉病育种中普遍应用的Cf-4抗病基因已被侵染，侵染Cf-9抗病基因的生理小种在华北地区也被检测出来[2]。已报道至少有24个抗叶霉病基因被发现，它们能够克服不同的叶霉病生理小种[3]，因而利用新的、具有较高抗性的Cf抗病基因将是我国叶霉病抗病育种的重要目标之一。番茄与叶霉病病原菌的互作遵循“gene-for-gene”学说[4]，开展番茄抗叶霉病育种工作要根据当地叶霉病病原菌生理小种的分化情况，利用抗病基因对不同生理小种的抗病性进行鉴定。传统的人工接种抗病性鉴定不仅需要较长的时间和花费较多的人力物力，直接影响多抗性新材料及新品种的选育进程，而且还易受环境条件、接种技术等影响，从而导致鉴定结果不稳定。抗病育种是一个长期策略，合理利用抗病种质资源保持持久抗性十分重要。分子标记技术为快速筛选鉴定抗病基因提供了有力手段，利用分子标记技术对番茄叶霉病抗病基因的研究方面已取得较大进展，Cf-4和Cf-9基因紧密连锁位于1号染色体短臂的Milky Way位点；Cf-2和Cf-5基因紧密连锁位于6号染色体短臂，Cf-6基因同样位于6号染色体短臂；Cf-11、Cf-12和Cf-19基因也分别被定位于染色体上[5-10]。

本研究应用SSR和AFLP标记方法对Cf-16基因进行分子标记研究，并将获得的与Cf-16基因连锁的AFLP标记转化为SCAR标记，从而为开展Cf-16基因的相关分子标记辅助育种和基因克隆奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

番茄抗叶霉病材料Ontario 7816（含Cf-16基因，不含其他抗叶霉病基因）由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供；番茄感病亲本材料07880（不含任何抗叶霉病基因），亲本杂交（Ontario 7816为母本，07880为父本）的F1代，F1代自交获得的F2代分离群体，番茄感叶霉病通用对照品种Money Maker（含Cf-0基因），番茄叶霉病优势生理小种1.2.3.4[11]以及64份番茄自交系种质均由东北农业大学番茄研究所收集、分离和鉴定。

1.2 方法

1.2.1 接种方法及病情分级标准 接种采用喷雾接种法[10]。接种苗龄为4片真叶期，浓度为107个孢子/mL。接种后3 d内保持相对湿度100%，温度22～25 ℃，使叶霉菌进行繁殖，3 d后相对湿度降至80%保持11 d，接种14 d后调查发病情况。

单株分级标准：0级——无症状；1级——接种叶有直径1 mm的白斑或坏死斑；3级——接种叶有直径2～3 mm的黄化斑，叶背面有少量白色霉状物；5级——接种叶有直径5～8 mm的黄化斑，叶背面有许多白色霉状物；7级——接种叶有直径5～8 mm的黄化斑，叶背面有黑色霉状物，同时上部叶片也有黑色霉状物；9级——接种叶病斑上有大量孢子，上部叶片也有孢子形成。

1.2.2 叶片基因组DNA的提取及抗、感池的建立 叶片基因组DNA的提取采用CTAB法[12]，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，分光光度計测定DNA的浓度，调整各样品DNA浓度为50 ng/μL。从F2代分离群体中随机选取10株抗病植株和感病植株，参照Michelmore等[13]的混合分组分析法，建立抗病池和感病池，各取等量的DNA混合，对在双亲间表现多态性的引物进行进一步的筛选。

1.2.5 AFLP-SCAR标记的转化 用灭菌的手术刀片切割目标差异条带，溶解于30 μL ddH2O中，37 ℃过夜，12 000 r/min离心10 s，以上清液为模板进行PCR扩增，扩增体系同选择性扩增体系。对扩增产物的目标片段进行回收，克隆于pEASY-T1载体，转化后测序。根据测序结果及EcoRⅠ和MseⅠ核心引物序列设计SCAR引物，并对两亲本、混合基因池及F2代单株进行PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 人工接种抗性鉴定及遗传分析

2.2 SSR分析

2.3 AFLP分析

2.4 AFLP-SCAR标记的转化

2.5 种质资源鉴定

对64份番茄自交系种质进行人工接种鉴定，共筛选出16份抗叶霉病材料，应用获得的AFLP-SCAR引物进行分子鉴定（表1），共鉴定出3份含有Cf-16基因的抗叶霉病番茄材料分子标记检测和人工接种鉴定的结果完全吻合，说明获得的分子标记是可靠的，不仅在分子水平上验证了分子标记的实用性与准确性，而且完全可以在番茄抗叶霉病育种中应用。

3 小结与讨论

20世纪30年代以来，加拿大和美国就开始番茄叶霉病抗病育种研究，并从栽培番茄及野生番茄中筛选出多个抗源应用于番茄抗病育种。目前，国内育成的抗叶霉病番茄品种应用的是Cf-4和Cf-9基因。从国内各地区关于番茄叶霉病病原菌生理小种分化的监测结果来看，能够侵染Cf-4基因的生理小种1.2.3.4是我国大部分地区的优势生理小种，Cf-4基因已经丧失抗性，并发现侵染Cf-9基因的生理小种1.2.3.4.9[2]。利用具有较高抗性的基因是我国叶霉病抗病育种的重要目标。抗病育种是一个长期工作，因而提前对较高抗性、且尚未应用的葉霉病抗病基因Cf-16进行研究，建立分子标记辅助选择体系，在时间上获得主动权，为应对新分化的致病性更强的番茄叶霉病生理小种做好准备是十分重要的工作。

分子标记技术的应用使我们能够快速地进行染色体定位和分子标记辅助选择。应用SSR标记方法，根据与Cf-16基因连锁的SSR标记Tom144-145，将Cf-16基因定位于11号染色体，与Kanwar等[17]通过经典遗传定位的结果相同。AFLP标记技术同样广泛应用于植物的遗传多样性分析、分子标记辅助选择等。本研究中共获得5个与Cf-16基因连锁的标记，其中标记E-ACA/M-TCG219与目标基因的遗传距离为4.7 cM，小于5.0 cM，能够应用于分子标记辅助选择。但是，AFLP标记方法的操作比较复杂，并且需要经过酶切、连接等步骤，操作昂贵，不适于大规模及大群体的选择使用，因此，本研究试图将AFLP标记转化为以PCR为基础的SCAR标记。根据测序后获得的序列信息，将E-ACA/M-TCG219标记转化为SCAR标记，经F2分离群体人工接种鉴定验证，吻合率为90%以上，表明筛选出的AFLP-SCAR标记能够应用于分子标记辅助选择育种。

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