红芪多糖含量测定方法研究

欧阳亦华 颜 剑

（1广东省广州市番禺区人口和计划生育服务站药剂科，广州511400；2广西中医药大学药学院，南宁530001）

红芪多糖含量测定方法研究

欧阳亦华1颜 剑2

（1广东省广州市番禺区人口和计划生育服务站药剂科，广州511400；2广西中医药大学药学院，南宁530001）

目的 建立一种红芪多糖含量测定的方法。方法采用80%乙醇回流除去蛋白、氨基酸、单糖、双糖、低聚糖等杂质，并用热水分离提取红芪多糖，以葡萄糖作为换算因子，绘制标准曲线，用蒽酮-硫酸分光光度法对红芪多糖含量进行测定。结果检测波长为625nm，得到葡萄糖标准曲线回归方程为y＝6.3263*c＋0.1271，R2＝0.9917，线性范围为0～0.2mg／ml。该测定方法供试液在2h内显色稳定，精密度、稳定性和重复性良好，平均回收率100.53%，RSD＜3.0%，测得红芪多糖的含量为6.62%。结论蒽酮-硫酸法操作简便，重现性好，准确，可靠，可作为红芪多糖的测定。

红芪；多糖；含量；测定

红芪（Radix hedysari）为多序岩黄芪的干燥根，又名岩黄芪、晋芪、独根，其与黄芪同科不同属，最早记载于《神农本草经》［1］。中医理论认为红芪性温，味甘，其功效主要包括补气生阳、固表止汗、消肿利尿、敛疮生肌等［2］。近三十年，较多学者对红芪化学成分及其药理活性进行了大量研究，发现红芪中含有多糖、皂苷、黄酮、生物碱、有机酸及微量元素等，其药理活性包括增强免疫、强心利尿、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎等［3］。多糖（polysaccharide）是一类具有广泛药理活性天然高分子化合物，由10个以上单糖通过糖苷键连接而成，在生物机体内多糖是维持正常生命活动的基本物质。文献研究表明，红芪多糖具有促血管生成、抗自由基、免疫调节、降血糖、抗肿瘤、抗衰老等活性［4］。本研究针对红芪多糖的含量测定研究，建立一种准确、快速、可行的测定方法，为开发利用红芪多糖提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器UV-2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；BS423S电子天平，德国赛多利斯公司；HH-8数显恒温水浴锅，常州中诚仪器制造有限公司；N-1100V-W旋转蒸发仪，日本东京理化；D5-RZ型离心沉淀机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；DZG-6050型真空干燥箱，南京华奥干燥设备有限公司。

1.2 材料葡萄糖对照品来自中国药品生物制品检定所（批号：110833-200904），无水乙醇、正丁醇、石油醚、浓硫酸、蒽酮、丙酮、乙醚、氯仿试剂均为国产分析纯，水为双蒸水。药材红芪购自甘肃。

2 实验方法

2.1 精制红芪多糖的制备称红芪，粉碎过筛，取50目粉约10g，精密称定，加入索氏提取器，用100ml石油醚80℃回流提取2h脱脂，过滤，弃去滤液。之后将滤渣挥干溶剂放入索氏提取器，继续加入200ml 80%乙醇90℃回流1h，过滤，弃去滤液。之后将滤渣挥干溶剂放入索氏提取器，继续加入400ml双蒸水，于沸水浴中回流1h，过滤，将滤液于4000 r／min离心分离10min，取上清液浓缩，用Sevage［5］法除去蛋白。之后用自来水透析48h，双蒸水透析24h，向透析液中加入无水乙醇使乙醇浓度达80%，醇沉过夜。之后4000 r／min离心分离醇沉液，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，真空干燥至恒重，即得红芪多糖。称重红芪多糖，密封冷藏备用。

2.2 最大吸收波长的确定吸取一定量的葡萄糖标准溶液和红芪多糖溶液，分别置于10ml具塞试管中，按照蒽酮-硫酸试剂显色方法显色，用双蒸水作空白对照，葡萄糖标准溶液和红芪多糖溶液分别于500～750nm范围扫描，确定最大吸收波长。

2.3 标准曲线的绘制精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品试剂250.0mg，用少量双蒸水溶解，放置250ml容量瓶中，用双蒸水定容至刻度，摇匀，配成1.0mg／ml的标准溶液。分别吸取2.5、5.0、10.0、15.0、20.0ml标准溶液，分别置于100ml容量瓶中，用双蒸水定容至刻度，配成不同浓度的葡萄糖标准溶液。分别吸取1ml不同浓度的葡萄糖标准溶液试管中，并以1ml双蒸水作空白，各试管中分别加入3.3mg／ml的蒽酮-硫酸溶液4ml，立刻摇匀，置于冰水中放冷，之后置于沸水浴中加热5min，放冷至室温，于波长625nm处测定OD值，依据不同的OD值绘制标准曲线，得到回归方程。

2.4 换算因子的测定精密称取红芪多糖10.0mg，用少量双蒸水溶解，放置50ml容量瓶中，用双蒸水定容至刻度，摇匀，配成红芪多糖测定液。于波长625nm处测定其OD值（A），由回归方程求出由葡萄糖作为标准溶液的红芪多糖中葡萄糖含量，按如下换算公式进行计算：

注：w为称取红芪多糖的质量（mg），c为红芪多糖中葡萄糖浓度（mg／ml），d为多糖的稀释倍数（ml）。

2.5 红芪多糖制备称取红芪50目粉末5g，置索氏提取器，加入80ml 80%乙醇，90℃水浴回流提取1h，热滤，用80%热乙醇洗涤滤渣3次。滤渣置干燥器中挥干溶剂后取出，加80ml蒸馏水超声溶解，90℃水浴中浸提1h，热滤，滤渣按上述操作提取1次，热滤后合并滤液，4000r／min离心分离，取上清液置于200ml容量瓶中，用双蒸水稀释至刻度，摇匀。吸取10ml置于50ml容量瓶中，用双蒸水稀释至刻度，摇匀作为红芪多糖供试液备用。

3 结果

3.1 最大吸收波长葡萄糖标准溶液和精制红芪多糖样品溶液，经蒽酮-硫酸显色后用UV2550型紫外可见分光光度计在500～750nm范围扫描。扫描结果表明：葡萄糖标准溶液和红芪多糖样品溶液均在625nm处有最大吸收，确定该波长为测定波长。结果如图1。

图1 波长的确定

3.2 标准工作曲线的制备以标准品葡萄糖为浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为：y＝6.3263*c＋0.1271，R2＝0.9917，线性范围为0.025～0.2mg／ml，其中y为OD值，c为葡萄糖浓度。

3.3 换算因子干燥后的精制红芪多糖用水溶解后，在625nm处测定其OD值＝0.582，由回归方程计算其葡萄糖含量为0.072mg／ml，按换算公式计算得换算因子f＝2.78。

3.4 精密度实验精确吸取同一样品试液5份，各1.0ml，置于具塞试管中，加双蒸水1ml，摇匀，按照蒽酮-硫酸法测定OD值，平行测定5次，结果表明，相对标准偏差RSD＝0.88%，表明精密度良好。结果见表1。

表1 精密度实验（%）

3.5 稳定性实验精确吸取红芪多糖供试液5份，各1.0ml，置于具塞试管中，加双蒸水1ml，摇匀，按照蒽酮-硫酸法测定OD值，完全显色后，每隔15min记录一次OD值，考察2h内稳定性。不同时间点测量结果RSD＝0.42%，表明红芪多糖供试液的吸光度在2h内稳定。结果见表2。

表2 稳定性实验（%）

3.6 重复性实验称取6份1.0g干燥过50目筛红芪粉末，按2.5方法进行处理，制取6份样品溶液，各取1ml样品溶液于具塞试管中，加双蒸水1ml，摇匀，按照蒽酮-硫酸法测定OD值，平行测定3次取平均，得到标准偏差RSD＝1.21，重复性好，可靠性高。结果见表3。

表3 重复性收实验（%）

3.7 加样回收实验称取3份1.0g干燥过50目筛红芪粉末，按2.5方法进行处理，每组做3份平行，各取1ml样品溶液于具塞试管中，加双蒸水1ml，摇匀，并分别加入一定量葡萄糖标准溶液，按照蒽酮-硫酸法测定OD值，计算回收率平均值为100.53%，RSD＝2.37%。结果见表4。

表4 加样回收实验（%）

3.8 多糖含量测定精确称取3份红芪50目筛粉末，各1g，按照2.5的方法制备红芪多糖，精确吸取样品溶液1.0ml，分别置于具塞试管中，加双蒸水1ml，摇匀，按照蒽酮-硫酸法测定OD值，根据回归方程，计算红芪多糖含量＝cdf／w×l00%＝1.53%［w为称取样品质量（mg），c为红芪多糖中葡萄糖浓度（mg／ml），d为多糖的稀释倍数（ml）］。以蒽酮-硫酸法测得红芪多糖含量为6.62%，结果见表5。

表5 红芪多糖含量测定（%）

4 讨论

本文通过采用精制红芪多糖测定红芪多糖中葡萄糖的含量，并确定其换算因子，该方法能有效避免直接用葡萄糖作标准引起误差。通过对红芪多糖含量测定方法进行的精密度、稳定性和加样回收率实验，表明该多糖含量测量方法具有良好的精密度、准确度，且该方法稳定。本方法操作简单易行，方便快捷，稳定可靠，灵敏度较高，所需仪器、试剂价格低廉，可以在常规实验条件下进行，本方法适用于红芪多糖的测定，为红芪多糖产品的开发提供基础理论。

［1］罗文蓉，杨扶德，张雅聪．红芪的生药学研究［J］．时珍国医国药，2004，15（3）：157．

［2］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［S］．2010年版．北京：中国医药科技出版社，2010：142．

［3］杨林，谭玉玲．中药红芪研究现状［J］．中外医疗，2010，（5）：120-121．

［4］党子龙，刘小花，赵安娜．红芪多糖HPS4-1A的化学结构特征研究及分子构象初步分析［J］．中草药，2013，44（2）：141-146．

［5］徐静静，艾训儒，李琴，等．正交试验优选延龄草多糖提取工艺研究［J］．黑龙江医药科学，2011，34（6）：9-10．

St u d y o n t he De t e r mina tio n Me t h o d o f Poly s ac c ha rid e Con t e n t in Ra dix He d y s a ri

Ouyang Yihua1Yan Jian2(1 Department of p harmacy,p opulation and Family p lanning Service Station,panyu D istrict,Guangzhou,Guangdong p rovince,511400,China; 2 College of pharmacy,Guangxi University of Traditional Chinese M edicine,Nanning,Guangxi p rovince,530001,China)

Objective To establish a radix hedysari Polysaccharide determination method．MethodsRadix hedysari polysaccharide was extracted by 80%ethanol to remove out protein，amino acids，monosaccharides，disaccharides，oligosaccharides and other impurities．and the polysaccharide used glucose as a conversion factor，then obtained the standard curve．The polysaccharide was determined with anthrone-sulfuric acid spectrophotometry．ResultsThe detection wavelength was 625nm，and the glucose standard curve regression equation was y＝6.3263*c＋0.1271，R2＝0．9917，and linear range was 0～0.2mg／ml．The method was simple and feasible for the color stability of test solution within 2h．The precision and stability was good．The average recovery was 100.53%，and all RSD＜3.0%．The polysaccharide content in radix hedysari is 6.62%．ConclusionThe anthrone-sulfuric acid method is simple，reproducible，accurate and reliable，which can be preferably used as the method of determination of radix hedysari polysaccharide．

Radix hedysari；Polysaccharides；Content；Determination

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.20.103

1672-2779（2013）-20-0149-03

杨 杰

2013-08-17）