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红芪多糖含量测定方法研究

2013-04-27欧阳亦华

中国中医药现代远程教育 2013年20期
关键词:回归方程硫酸标准溶液

欧阳亦华 颜 剑

(1广东省广州市番禺区人口和计划生育服务站药剂科,广州511400;2广西中医药大学药学院,南宁530001)

红芪多糖含量测定方法研究

欧阳亦华1颜 剑2

(1广东省广州市番禺区人口和计划生育服务站药剂科,广州511400;2广西中医药大学药学院,南宁530001)

目的 建立一种红芪多糖含量测定的方法。方法采用80%乙醇回流除去蛋白、氨基酸、单糖、双糖、低聚糖等杂质,并用热水分离提取红芪多糖,以葡萄糖作为换算因子,绘制标准曲线,用蒽酮-硫酸分光光度法对红芪多糖含量进行测定。结果检测波长为625nm,得到葡萄糖标准曲线回归方程为y=6.3263*c+0.1271,R2=0.9917,线性范围为0~0.2mg/ml。该测定方法供试液在2h内显色稳定,精密度、稳定性和重复性良好,平均回收率100.53%,RSD<3.0%,测得红芪多糖的含量为6.62%。结论蒽酮-硫酸法操作简便,重现性好,准确,可靠,可作为红芪多糖的测定。

红芪;多糖;含量;测定

红芪(Radix hedysari)为多序岩黄芪的干燥根,又名岩黄芪、晋芪、独根,其与黄芪同科不同属,最早记载于《神农本草经》[1]。中医理论认为红芪性温,味甘,其功效主要包括补气生阳、固表止汗、消肿利尿、敛疮生肌等[2]。近三十年,较多学者对红芪化学成分及其药理活性进行了大量研究,发现红芪中含有多糖、皂苷、黄酮、生物碱、有机酸及微量元素等,其药理活性包括增强免疫、强心利尿、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎等[3]。多糖(polysaccharide)是一类具有广泛药理活性天然高分子化合物,由10个以上单糖通过糖苷键连接而成,在生物机体内多糖是维持正常生命活动的基本物质。文献研究表明,红芪多糖具有促血管生成、抗自由基、免疫调节、降血糖、抗肿瘤、抗衰老等活性[4]。本研究针对红芪多糖的含量测定研究,建立一种准确、快速、可行的测定方法,为开发利用红芪多糖提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器UV-2550紫外可见分光光度计,日本岛津公司;BS423S电子天平,德国赛多利斯公司;HH-8数显恒温水浴锅,常州中诚仪器制造有限公司;N-1100V-W旋转蒸发仪,日本东京理化;D5-RZ型离心沉淀机,湖南湘仪离心机仪器有限公司;DZG-6050型真空干燥箱,南京华奥干燥设备有限公司。

1.2 材料葡萄糖对照品来自中国药品生物制品检定所(批号:110833-200904),无水乙醇、正丁醇、石油醚、浓硫酸、蒽酮、丙酮、乙醚、氯仿试剂均为国产分析纯,水为双蒸水。药材红芪购自甘肃。

2 实验方法

2.1 精制红芪多糖的制备称红芪,粉碎过筛,取50目粉约10g,精密称定,加入索氏提取器,用100ml石油醚80℃回流提取2h脱脂,过滤,弃去滤液。之后将滤渣挥干溶剂放入索氏提取器,继续加入200ml 80%乙醇90℃回流1h,过滤,弃去滤液。之后将滤渣挥干溶剂放入索氏提取器,继续加入400ml双蒸水,于沸水浴中回流1h,过滤,将滤液于4000 r/min离心分离10min,取上清液浓缩,用Sevage[5]法除去蛋白。之后用自来水透析48h,双蒸水透析24h,向透析液中加入无水乙醇使乙醇浓度达80%,醇沉过夜。之后4000 r/min离心分离醇沉液,将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次,真空干燥至恒重,即得红芪多糖。称重红芪多糖,密封冷藏备用。

2.2 最大吸收波长的确定吸取一定量的葡萄糖标准溶液和红芪多糖溶液,分别置于10ml具塞试管中,按照蒽酮-硫酸试剂显色方法显色,用双蒸水作空白对照,葡萄糖标准溶液和红芪多糖溶液分别于500~750nm范围扫描,确定最大吸收波长。

2.3 标准曲线的绘制精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品试剂250.0mg,用少量双蒸水溶解,放置250ml容量瓶中,用双蒸水定容至刻度,摇匀,配成1.0mg/ml的标准溶液。分别吸取2.5、5.0、10.0、15.0、20.0ml标准溶液,分别置于100ml容量瓶中,用双蒸水定容至刻度,配成不同浓度的葡萄糖标准溶液。分别吸取1ml不同浓度的葡萄糖标准溶液试管中,并以1ml双蒸水作空白,各试管中分别加入3.3mg/ml的蒽酮-硫酸溶液4ml,立刻摇匀,置于冰水中放冷,之后置于沸水浴中加热5min,放冷至室温,于波长625nm处测定OD值,依据不同的OD值绘制标准曲线,得到回归方程。

2.4 换算因子的测定精密称取红芪多糖10.0mg,用少量双蒸水溶解,放置50ml容量瓶中,用双蒸水定容至刻度,摇匀,配成红芪多糖测定液。于波长625nm处测定其OD值(A),由回归方程求出由葡萄糖作为标准溶液的红芪多糖中葡萄糖含量,按如下换算公式进行计算:

注:w为称取红芪多糖的质量(mg),c为红芪多糖中葡萄糖浓度(mg/ml),d为多糖的稀释倍数(ml)。

2.5 红芪多糖制备称取红芪50目粉末5g,置索氏提取器,加入80ml 80%乙醇,90℃水浴回流提取1h,热滤,用80%热乙醇洗涤滤渣3次。滤渣置干燥器中挥干溶剂后取出,加80ml蒸馏水超声溶解,90℃水浴中浸提1h,热滤,滤渣按上述操作提取1次,热滤后合并滤液,4000r/min离心分离,取上清液置于200ml容量瓶中,用双蒸水稀释至刻度,摇匀。吸取10ml置于50ml容量瓶中,用双蒸水稀释至刻度,摇匀作为红芪多糖供试液备用。

3 结果

3.1 最大吸收波长葡萄糖标准溶液和精制红芪多糖样品溶液,经蒽酮-硫酸显色后用UV2550型紫外可见分光光度计在500~750nm范围扫描。扫描结果表明:葡萄糖标准溶液和红芪多糖样品溶液均在625nm处有最大吸收,确定该波长为测定波长。结果如图1。

图1 波长的确定

3.2 标准工作曲线的制备以标准品葡萄糖为浓度为横坐标,以OD值为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程为:y=6.3263*c+0.1271,R2=0.9917,线性范围为0.025~0.2mg/ml,其中y为OD值,c为葡萄糖浓度。

3.3 换算因子干燥后的精制红芪多糖用水溶解后,在625nm处测定其OD值=0.582,由回归方程计算其葡萄糖含量为0.072mg/ml,按换算公式计算得换算因子f=2.78。

3.4 精密度实验精确吸取同一样品试液5份,各1.0ml,置于具塞试管中,加双蒸水1ml,摇匀,按照蒽酮-硫酸法测定OD值,平行测定5次,结果表明,相对标准偏差RSD=0.88%,表明精密度良好。结果见表1。

表1 精密度实验(%)

3.5 稳定性实验精确吸取红芪多糖供试液5份,各1.0ml,置于具塞试管中,加双蒸水1ml,摇匀,按照蒽酮-硫酸法测定OD值,完全显色后,每隔15min记录一次OD值,考察2h内稳定性。不同时间点测量结果RSD=0.42%,表明红芪多糖供试液的吸光度在2h内稳定。结果见表2。

表2 稳定性实验(%)

3.6 重复性实验称取6份1.0g干燥过50目筛红芪粉末,按2.5方法进行处理,制取6份样品溶液,各取1ml样品溶液于具塞试管中,加双蒸水1ml,摇匀,按照蒽酮-硫酸法测定OD值,平行测定3次取平均,得到标准偏差RSD=1.21,重复性好,可靠性高。结果见表3。

表3 重复性收实验(%)

3.7 加样回收实验称取3份1.0g干燥过50目筛红芪粉末,按2.5方法进行处理,每组做3份平行,各取1ml样品溶液于具塞试管中,加双蒸水1ml,摇匀,并分别加入一定量葡萄糖标准溶液,按照蒽酮-硫酸法测定OD值,计算回收率平均值为100.53%,RSD=2.37%。结果见表4。

表4 加样回收实验(%)

3.8 多糖含量测定精确称取3份红芪50目筛粉末,各1g,按照2.5的方法制备红芪多糖,精确吸取样品溶液1.0ml,分别置于具塞试管中,加双蒸水1ml,摇匀,按照蒽酮-硫酸法测定OD值,根据回归方程,计算红芪多糖含量=cdf/w×l00%=1.53%[w为称取样品质量(mg),c为红芪多糖中葡萄糖浓度(mg/ml),d为多糖的稀释倍数(ml)]。以蒽酮-硫酸法测得红芪多糖含量为6.62%,结果见表5。

表5 红芪多糖含量测定(%)

4 讨论

本文通过采用精制红芪多糖测定红芪多糖中葡萄糖的含量,并确定其换算因子,该方法能有效避免直接用葡萄糖作标准引起误差。通过对红芪多糖含量测定方法进行的精密度、稳定性和加样回收率实验,表明该多糖含量测量方法具有良好的精密度、准确度,且该方法稳定。本方法操作简单易行,方便快捷,稳定可靠,灵敏度较高,所需仪器、试剂价格低廉,可以在常规实验条件下进行,本方法适用于红芪多糖的测定,为红芪多糖产品的开发提供基础理论。

[1]罗文蓉,杨扶德,张雅聪.红芪的生药学研究[J].时珍国医国药,2004,15(3):157.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社,2010:142.

[3]杨林,谭玉玲.中药红芪研究现状[J].中外医疗,2010,(5):120-121.

[4]党子龙,刘小花,赵安娜.红芪多糖HPS4-1A的化学结构特征研究及分子构象初步分析[J].中草药,2013,44(2):141-146.

[5]徐静静,艾训儒,李琴,等.正交试验优选延龄草多糖提取工艺研究[J].黑龙江医药科学,2011,34(6):9-10.

St u d y o n t he De t e r mina tio n Me t h o d o f Poly s ac c ha rid e Con t e n t in Ra dix He d y s a ri

Ouyang Yihua1Yan Jian2(1 Department of p harmacy,p opulation and Family p lanning Service Station,panyu D istrict,Guangzhou,Guangdong p rovince,511400,China; 2 College of pharmacy,Guangxi University of Traditional Chinese M edicine,Nanning,Guangxi p rovince,530001,China)

Objective To establish a radix hedysari Polysaccharide determination method.MethodsRadix hedysari polysaccharide was extracted by 80%ethanol to remove out protein,amino acids,monosaccharides,disaccharides,oligosaccharides and other impurities.and the polysaccharide used glucose as a conversion factor,then obtained the standard curve.The polysaccharide was determined with anthrone-sulfuric acid spectrophotometry.ResultsThe detection wavelength was 625nm,and the glucose standard curve regression equation was y=6.3263*c+0.1271,R2=0.9917,and linear range was 0~0.2mg/ml.The method was simple and feasible for the color stability of test solution within 2h.The precision and stability was good.The average recovery was 100.53%,and all RSD<3.0%.The polysaccharide content in radix hedysari is 6.62%.ConclusionThe anthrone-sulfuric acid method is simple,reproducible,accurate and reliable,which can be preferably used as the method of determination of radix hedysari polysaccharide.

Radix hedysari;Polysaccharides;Content;Determination

10.3969/j.issn.1672-2779.2013.20.103

1672-2779(2013)-20-0149-03

杨 杰

2013-08-17)

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