谷物中伏马菌素B1残留的直接竞争ELISA检测方法研究

介明沙，张卫民，于 斐，玉崧成，吴拥军*，张洪权

（1.郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001；2.郑州大学 化学与分子工程学院，河南 郑州 450001；3.河南天方药业有限公司，河南 驻马店 463002）

0 引言

伏马菌素（Fumonisins）是一类主要由串珠镰刀菌产生的真菌毒素[1]，主要存在于玉米、小麦等谷物及其制品中.FB1是伏马菌素的主要组分，是导致Fumonisins 产生毒性的主要因素，其促癌性和致癌性已得到证实[2].国际癌症研究中心（IARC）把FB1划分到2B 组，即人类可能的致癌物[3].目前常用的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）[4]，高效液相色谱法（HPLC）[5-6]和酶联免疫吸附法（ELISA）[7-8]等；TLC 法应用较早，但其操作繁琐、灵敏度和特异性也较差；仪器检测灵敏、准确，研究与应用较多的是HPLC 法，但其成本高、需要昂贵的设备、样品前处理过程复杂、需要专业人员操作，推广使用受到一定限制；ELISA 法快速、灵敏、特异强，检测生物毒素残留安全、可靠，其规模化筛选特点使其更能满足常规化检测的需要[9].但是，目前常用的间接竞争ELISA 试验存在检测时间长、步骤繁琐等缺陷.本研究针对这一问题，通过HRP-FB1的制备和应用，建立直接竞争ELISA 检测方法，目的在于简化检测步骤、缩短检测时间、提高谷物中FB1残留的检测水平.

1 材料与方法

1.1 仪器

WELLSCAN MK3 酶标仪：Thermo；高效液相色谱仪：安捷伦；C18固相微萃取柱：Agela Technologies；UV-1606 紫外分光光度仪、Irprestige-21 型傅立叶红外分光光度仪：日本岛津；FW-100 型高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；XK96-A型快速混匀器：姜堰市新康医疗机械有限公司.

1.2 材料

用于加标试验的玉米样品购自洛阳市某超市（经HPLC 检测不含FB1残留）.

用于HPLC 检测的玉米样品取自河南驻马店、新乡等地区粮油公司.

辣根过氧化物酶HRP（RZ＞3.0，活性＞250 U/mg）：ROCHE Inc，SANLAND；FB1单抗（Abcam）、FB1标准品、卵清蛋白（OVA）：Sigma 公司；酶标抗原HRPFB1为自制；ELISA 显色液A、B：河南华美生物公司；其他试剂均为分析纯.

1.3 酶标抗原HRP-FB1 的制备

取2 mL 0.1 mg/mL 的HRP 溶液逐滴加入到3 mL 1.6×10-3mg/mL 的FB1溶液中，混匀后逐滴加入2.5%的戊二醛溶液1.6 mL，避光搅拌4 h 后向此溶液中加入0.8 mL 1 mol/L 的乙醇胺，室温温育15～20 min，将所得溶液装入透析袋中，用PBS 缓冲溶液（0.01 mol/L，pH7.2）透析3 d.

1.4 样品的前处理

首先将玉米样品用高速粉碎机粉碎，过300 目分子筛，然后进行四分法缩分，取5 g 样品，放入100 mL 的具塞试管中，加入75%的甲醇溶液10 mL，振荡提取30 min，5 000 r/min 条件下离心15 min，滤纸过滤，保留滤液，用PBS 进行5 倍稀释，4 ℃保存，供ELISA 检测所用.

1.5 试验方法

（1）包被：用Tris-HCl 缓冲溶液（pH 9.6，0.1 mol/L）将FB1单抗1∶8 000 稀释后包被到96 孔酶标板上，每孔200 μL，37 ℃温育2 h；（2）洗涤：每孔用洗涤液PBST 洗涤2 次，弃去洗涤液，在吸水纸上拍干；（3）封闭：用1%的OVA-PBS 缓冲液封闭，每孔300 μL，37 ℃温育2 h，洗涤3 次后拍干；（4）竞争性免疫反应：每孔加入100 μL 的FB1标准品溶液或谷物样品提取液和100 μL 的HRP-FB1溶液，37 ℃温育1 h，重复洗涤过程；（5）显色反应：各孔依次加入显色液A、B 各50 μL，37 ℃避光反应20 min；（6）终止反应：每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4终止液；（7）吸光度测定：酶标仪在490 nm波长处测定各孔吸光度A（参比吸光度为630 nm）.

1.6 标准曲线的绘制

配制质量浓度分别为200、300、400、500、600、800 ng/mL 的FB1标准溶液，以FB1质量浓度为横坐标，FB1标准样品各浓度孔的吸光度与FB1零标准品孔吸光度的比值（OD/OD0）为纵坐标，绘制标准曲线.

1.7 精密度及加标回收率

在处理好的空白玉米样品溶液（HPLC 鉴定）中，分别加入FB1标准品，配制质量浓度为200、400、600 ng/mL 的3 个加标样品溶液，采用本方法进行检测，每个浓度测定6 次，考察ELISA 法检测加标玉米样品的精密度和准确度，并与HPLC 法进行比较.

1.8 HPLC 确证试验

取C18固相微萃取柱净化后的阳性样品溶液适量，应用HPLC 进行确证试验[10].

1.9 特异性考察

选取真菌毒素呕吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黄曲霉毒素B1（AFB1），按照ELISA 操作步骤得出相应的抑制率，计算交叉反应率.

2 结果与讨论

2.1 HRP-FB1 的制备及表征

参照文献[11]，选用戊二醛法制备HRP-FB1偶联物，分别采用紫外光谱法和红外光谱法对其进行表征.利用紫外可见光谱比较FB1、HRP、FB1-HRP 的特征吸收峰：FB1在200 nm 附近有最大吸收峰，HRP 在405、265、205 nm 有特征吸收峰；而FB1-HRP 的特征吸收峰为405、265、205 nm，初步推断偶联成功.同时根据红外光谱扫描情况可知，FB1-HRP 在3 410～3 460 cm-1范围内具有较强较宽的吸收峰，包括FB1分子N—H 键伸展振动产生的3 410 cm-1吸收峰和HRP 分子内O—H 键伸展振动产生3 462 cm-1吸收峰，并且在1 612 cm-1出现FB1的特征吸收峰，确认偶联成功.

2.2 ELISA 法标准曲线、精密度及加标回收率

按照ELISA 方法测定一系列浓度的标准溶液，根据测定结果绘制标准曲线，结果见图1.得出标准曲线方程为Y=-0.000 8X+0.978 9，X 为FB1的质量浓度，Y 为FB1标准样品各浓度孔的吸光度与FB1零标准品孔吸光度的比值（OD/OD0），线性范围在200～800 ng/mL 之间，根据OD/OD0=1.2 求得检测限[12]为182.4 ng/mL.以200、400、600 ng/mL3 个加标样品平行测定6 次，分别做批间变异和批内变异试验，得到批内变异系数为6.4%～8.3%，平均批内变异系数为7.4%；批间变异系数为6.2%～9.5%，平均批间变异系数为7.7%，均小于10%；应用ELISA 法平行测定6 次，检测加标样品中FB1的回收率在85%～105%之间，平均回收率为98.5%.

图1 ELISA 法测定FB1 的标准曲线

2.3 ELISA 法与HPLC 法的方法学比较

比较ELISA 法与HPLC 法的线性范围、精密度及回收率，结果见表1.由表1 可见，ELISA 法回收率较高，其灵敏度、精密度能满足实际需求.

表1 ELISA 与HPLC 的方法学比较（n=6）

2.4 HPLC 确证试验

同时采用ELISA 与HPLC 法检测阳性样品，相关性采用直线相关和回归分析，以HPLC 法测得的结果为横坐标，以ELISA 法测得的结果为纵坐标作线性回归分析.结果显示，二者相关性良好（r=0.999 6），ELISA 法回收率较高.

2.5 特异性考察结果

选取真菌毒素呕吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黄曲霉毒素B1（AFB1），用PBS 配制一系列质量浓度的溶液，按照ELISA 标准曲线的操作步骤得到相应的抑制率，计算交叉反应率（Cross-reactivity，CR），过程如下：以不同浓度的抗原和结构类似抗原物质分别求各自IC50，按下列公式计算交叉反应率，结果见表2.

式中:CR 为交叉反应率；y 为FB1抗原的IC50；Z 为结构类似抗原的IC50.

表2 ELISA 方法检测FB1 的特异性

由表2 可知，伏马菌素FB1单抗对其他真菌毒素无特异性反应，说明建立的ELISA 方法测定FB1特异性良好.

3 结论

从ELISA 与HPLC 方法学比较数据来看，国标方法在灵敏度、精密度、线性范围上都优于ELISA，但是ELISA 方法前处理简单、省时，而HPLC 前处理极其复杂，处理过程中待测毒素有一定程度损失，造成回收率偏低.从确证试验看，二者相关性良好.ELISA 方法具有实际推广意义.

综上所述，本研究采用自制的HRP-FB1建立的dc-ELISA 方法虽在灵敏度和精密度方面较国标方法稍差，但其前处理简单、检测时间短，可实现大批量样品的检测；相比间接竞争ELISA（idc-ELISA），其检测速度较快，可以应用于检测玉米等谷物中的FB1含量，其准确、高效、成本低，适于在非实验室或半实验室条件下对大批量样品进行初筛检测.

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