聚酰胺胺超支化聚合物的细胞毒性及抗菌性能

饶发明, 林 希, 黄维哲 ，吴江渝*

(1. 武钢集团矿业有限公司乌龙泉矿，湖北 武汉 430213;2. 武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北 武汉 430074)

0 引 言

抑制微生物生长和繁殖的工艺是水处理中非常重要的一环，直接决定了水质及其使用范围.传统的水处理抗菌试剂主要是含氯氧化剂，如液氯、二氧化氯和氯胺等，这些抗菌试剂在杀菌的同时会与水中的微量有机物发生化学反应，生成三氯甲烷等具有高毒副作用的副产物，严重影响人体健康.因此，各种水处理抗菌剂被广泛研究用以替代含氯试剂，如纳米二氧化钛材料[1]、纳米金属材料[2]、有机无机杂化材料[3-4]以及一些生物活性分子[5-6]等.超支化聚合物[7-8]是一类具有高度支化分子结构以及大量末端官能团的高分子化合物.这类化合物合成方法简便，制备成本低廉，加上其独特的分子结构特性，是理想的水处理试剂基体，并已被用于絮凝脱色[9]及重金属离子移除[10]的研究.

聚酰胺胺型超支化化合物[11-12]是超支化聚合物的重要类别，其末端具有大量的伯胺基团，可以通过与细菌的细胞膜相互作用而抑制其生长繁殖，因此超支化聚酰胺胺化合物可用于抗菌试剂开发.本研究选用乙二胺和丙烯酸甲酯为原料，首先反应生成小分子预聚物，继而通过逐步升温使其聚合成具有高分子量和高度支化结构的超支化聚酰胺胺化合物.以Hela细胞为实验对象对合成的超支化化合物进行了细胞毒性的测试.以大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄葡萄球菌(革兰氏阳性菌)为实验对象测试了超支化聚酰胺胺化合物的抗菌性能，以期为开发新型水处理抗菌试剂提供相关实验基础及理论依据.

1 实验部分

1.1 原料

乙二胺(国药集团化学试剂有限公司生产，分析纯，用前重蒸)，丙烯酸甲酯(国药集团化学试剂有限公司生产，分析纯，用前重蒸)，Hela细胞由武汉大学化学与分子科学学院提供，大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均由华中师范大学生命科学学院提供.

1.2 超支化聚酰胺胺的合成

10 g乙二胺溶于5 mL甲醇，缓慢滴加14.3 g丙烯酸甲酯，常温搅拌反应，得到小分子预聚物.所得预聚物通过60，80，100，120，140 ℃逐步升温，升温过程采用油泵真空处理，得到黄色透明状固体，用乙醚多次沉降后透析，经冷冻干燥得到超支化聚酰胺胺化合物.合成路线如图1所示.所得超支化聚合物经核磁共振氢谱及红外光谱表征[13].

图1 超支化聚酰胺胺的合成Fig.1 The synthesis of hyperbranched PAMAM

1.3 细胞毒性实验

选用Hela细胞，接种到24孔板中，细胞密度为25 000 个/孔，在DMEN培养基中37 ℃培养24 h.以培养基为溶剂，在24孔板中引入超支化聚酰胺胺化合物，最高质量浓度为80 mg/mL，最低质量浓度为0.002 44 mg/mL，并作空白对照.24 h后于24孔板中加入MTT试剂(终质量浓度为0.05 mg/mL)，反应4 h后，移除多余溶液，加入DMSO，染色后细胞呈紫色，利用酶标仪测量吸光度，在590 nm处测得细胞溶液的吸收值，并计算细胞成活率.

1.4 抑菌实验

1.4.1 超支化聚酰胺胺对大肠杆菌的抑菌实验 选用大肠杆菌接种到96孔板LB培养液中生长，同时引入超支化聚酰胺胺化合物，最高质量浓度为25 mg/mL，最低质量浓度为0.012 2 mg/mL，并作空白对照.将含有超支化聚酰胺胺的大肠杆菌培养液及空白对照置于摇床培养，每隔半小时对菌种生长情况进行测量，并记录结果.

1.4.2 超支化聚酰胺胺对金黄葡萄球菌的抑菌实验 选用金黄葡萄球菌接种到96孔板LB培养液中生长，同时引入超支化聚酰胺胺化合物，最高质量浓度为25 mg/mL，最低质量浓度为0.012 2 mg/mL，并作空白对照.将含有超支化聚酰胺胺的大肠杆菌培养液及空白对照置于摇床培养，每隔半小时对菌种生长情况进行测量，并记录结果.

2 结果与讨论

2.1 超支化聚酰胺胺的细胞毒性

图2是超支化聚酰胺胺化合物对Hela细胞的毒性测试结果：

图2 超支化聚酰胺胺对Hela细胞的毒性测试 Fig.2 The test of cytotoxicity of hyperbranched PAMAM with Hela cells 注：lnC为化合物质量浓度的对数值，C的单位为mg/mL.

细胞毒性实验结果说明，在较低浓度时(lnC值在-4.5～-6之间)，超支化聚酰胺胺对Hela细胞的毒性较小，细胞成活率在80%以上，随浓度升高，化合物溶液的细胞毒性逐渐增大，但直到质量浓度为20 mg/mL时(lnC≈3)，细胞成活率仍保持在50%以上.继续增加浓度导致超支化聚酰胺胺的细胞毒性上升，质量浓度为80 mg/mL时，细胞成活率在30%左右.

超支化聚酰胺胺的细胞毒性来自于其表面大量的伯胺基团.细胞由细胞壁，细胞质和细胞核组成，其中细胞壁含有大量的磷脂.超支化聚酰胺胺表面的伯胺基带正电荷，易与带负电荷的磷脂结合破坏细胞壁，从而导致细胞壁的破裂，使营养物质流出，细胞因此凋亡.

2.2 超支化聚酰胺胺的抗菌性能

2.2.1 对大肠杆菌(革兰氏阳性菌)的抑制结果 选取质量浓度为25、12.5、3.125 mg/mL和1.563 mg/mL超支化聚酰胺胺化合物的抑菌曲线作图，如图3所示.横坐标为细菌生长时间，纵坐标为细菌溶液吸光度，用以说明细菌的繁殖程度.空白对照，即不含超支化聚酰胺胺化合物的大肠杆菌生长情况.

图3 超支化聚酰胺胺对大肠杆菌的抗菌性能Fig.3 The antimicrobial activity of hyperbranched PAMAM with Escherichia coli

从图3中可知，在没有超支化聚酰胺胺存在时，大肠杆菌随时间增加繁殖程度变化明显，在约3 h之内繁殖较快，之后则速度放缓，但仍保持一定的生长趋势.在超支化聚合物浓度较低时(如1.563 mg/mL和3.125 mg/mL)，大肠杆菌在初期的生长速度虽略有下降，但仍然很快；而在3 h之后，溶液的吸光值基本保持不变，表明大肠杆菌的繁殖与消亡达到平衡.由此可知超支化聚酰胺胺在低浓度时即有一定的抗菌性能.在浓度较高时(如12.5 mg/mL和25 mg/mL)，超支化聚酰胺胺则可以完全抑制大肠杆菌的生长.其抑菌效果略低于文献报道[14].

2.2.2 对金黄葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的抑制结果 选取质量浓度为25、3.125、0.4 mg/mL和0.05 mg/mL超支化聚酰胺胺化合物的抑菌曲线作图，如图4所示.横坐标为细菌生长时间，纵坐标为细菌溶液吸光度，用以说明细菌的繁殖程度.空白对照，即不含超支化聚酰胺胺化合物的金黄葡萄球菌生长情况.

图4 超支化聚酰胺胺对金黄葡萄球菌的抗菌性能Fig.4 The antimicrobial activity of hyperbranched PAMAM with Staphylococcus aureus

从图4中可知，在没有超支化聚酰胺胺存在时，金黄葡萄球菌随时间增加繁殖程度变化明显，在测试时间范围内基本保持一定的生长速度.在所测试的较大浓度范围内(0.05～25 mg/mL)，超支化聚酰胺胺都可以显示出良好的抗菌性能，完全抑制金黄葡萄球菌的生长.该化合物抑菌效果优于文献报道[14].

从抑菌曲线可知超支化聚酰胺胺对大肠杆菌，金黄葡萄球菌的生长都有一定的抑制作用，但抑制效果有所不同.其中超支化化合物对革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌的抗菌效果要明显好于革兰氏阴性菌大肠杆菌.这与两种细菌的不同结构有关.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的差别主要来自于它们的细胞壁结构不同.革兰氏阳性菌的细胞壁壁厚约为20～80 nm，主要成分是肽聚糖和磷壁酸，二者含量占整个细胞壁质量的90%.革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，磷壁酸只占大约5%，但是其细胞壁组分比较复杂，有一层阳性菌所不具备的外膜结构，对于外源分子形成了一层附加的屏障，从而阻止其与细菌进行作用.超支化聚酰胺胺末端带有大量带正电荷的伯胺基团，属于阳离子抗菌剂.一般而言，阳离子抗菌剂通过破坏肽聚糖结构从而达到杀菌的目的.因此，超支化聚酰胺胺化合物对大肠杆菌的抑制效果不如金黄葡萄球菌.

通过合成得到的超支化聚酰胺胺对革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌及革兰氏阴性菌大肠杆菌均有一定的抑制效果，特别是对于金黄葡萄球菌有较佳的抗菌性能，可以以此为基础开发具有超支化结构的水处理抗菌剂.

3 结 语

a. 以丙烯酸甲酯和乙二胺为原料，通过逐步升温法制备了超支化聚酰胺胺化合物，其末端带有大量伯胺基团.

b. 对合成的超支化聚酰胺胺进行了细胞毒性测试，结果表明其细胞毒性随质量浓度增加而增大，在20 mg/mL以下时细胞毒性较小，细胞存活率在50%以上.

c. 以革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌及革兰氏阴性菌大肠杆菌为实验对象测试了超支化聚酰胺胺的抗菌性能，结果表明超支化聚酰胺胺对大肠杆菌和金黄葡萄球菌均有一定的抑制效果，在12.5 mg/mL时可以完全抑制大肠杆菌的生长，而在0.05 mg/mL浓度下即可完全抑制金黄葡萄球菌的生长.超支化聚酰胺胺化合物在水处理抗菌剂方面具有广阔的应用前景.

致 谢

本研究得到国家自然科学基金委员会的资助，特表感谢！

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