非小细胞肺癌患者血清粒细胞集落刺激因子水平测定及意义研究

马若亭，胡春宏，杨 敏

原发性支气管肺癌是我国的常见恶性肿瘤之一，在临床实践中可以观察到这样一种现象：某些非小细胞肺癌(NSCLC)患者在无感染等临床表现时，出现白细胞计数及中性粒细胞计数异常升高的现象，有的甚至出现类白血病反应，而在手术、放化疗后白细胞计数及中性粒细胞计数下降，这种现象可能与某些细胞因子的作用有关。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是细胞集落刺激因子家族4个亚型(Multi-CSF/IL-3、GM-CSF、M-CSF和G-CSF)之一，是由单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生的一种造血生长因子，能与细胞表面的特定受体结合，促使中性粒细胞系造血祖细胞生长和分化，可特异地调节粒系细胞的增殖和分化，保护中性粒细胞免凋亡，并增强成熟粒细胞的功能，对机体应激防御系统有重要意义。但1977年即有第1例报道，发现肺癌患者粒细胞增多是由肺癌组织产生G-CSF所引起[1]，许多国外学者的研究已通过检测血清G-CSF水平及肿瘤组织G-CSF的表达证实了肿瘤细胞可产生G-CSF。本研究采用酶联免疫法检测血清G-CSF水平在NSCLC患者手术前后的变化，分析血清G-CSF水平与NSCLC的临床病理因素的关系，以期对NSCLC的诊断、病情监测及预后判断有所帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集经病理证实初诊初治NSCLC患者50例为研究对象，其中男36例，女14例，男女比例为2.57∶1；年龄30～78岁，平均57岁；肿瘤临床分期:Ⅰ期29例、Ⅱ期13例、Ⅲ期8例；鳞癌23例、腺癌25例、大细胞癌2例。排除发热、感染、血液病、骨髓转移患者。术前外周血白细胞计数以术前1周检查结果为准，术后外周血白细胞计数以术后6～7 d检查结果为准。分别取手术前后清晨空腹静脉血5 ml，静置20 min，3 000 r/min，离心20 min，吸取血清分装保存在-20 ℃冰箱内，待测。

1.2 方法

1.2.1 临床资料的收集 依据住院病历和病理报告单，记录患者术前有无发热、手术前后外周血白细胞计数及中性粒细胞计数；肿瘤大小、有无坏死、有无淋巴结转移和远处转移或复发；肿瘤分期、分级；患者的性别、年龄。肿瘤分期根据2002年国际抗癌联盟(UICC)对NSCLC的TNM分期。血清G-CSF参考值为0～18.1 ng/L[2]。

1.2.2 ELISA法测定人G-CSF 分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，向人G-CSF ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程公司)加样。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育90 min。分别加入生物素化抗体工作液100 μl，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育60 min。分别加入酶结合物工作液100 μl，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育30 min。每孔分别加显色剂100 μl，避光37 ℃孵箱孵育15 min。每孔分别加终止液100 μl，混匀后即刻在450 nm波长(全自动紫外线分光光度计：美国Beckman Du-70)依序测量各孔的光密度(OD值)，以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，即为样品的实际浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。血清G-CSF水平、白细胞计数及粒细胞计数采用配对t检验，血清G-CSF水平与年龄、淋巴结转移的关系采用独立样本t检验，G-CSF表达与肿瘤组织学类型、临床分期、肿瘤分化程度之间的关系采用方差分析，G-CSF表达与肿瘤大小的关联采用双变量相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清G-CSF水平手术前后的变化 术后NSCLC患者血清G-CSF水平为(15.7±13.4)ng/L，低于术前的(33.3±30.4)ng/L，且差异有统计学意义(t=2.537，P<0.01)。

2.2 白细胞计数及中性粒细胞计数手术前后的变化 术后NSCLC患者外周血白细胞计数为(6.9±1.5)×109/L、中性粒细胞计数为(4.3±1.4)×109/L，均低于术前患者外周血白细胞计数(7.4±1.9)×109/L和中性粒细胞计数(4.9±1.8)×109/L，且差异有统计学意义(t白细胞计数=1.996，t中性粒细胞计数=1.912；均P<0.05)。

2.3 血清G-CSF水平与患者年龄的关系 年龄<60岁的NSCLC患者术前血清G-CSF水平为(41.5±29.1)ng/L，≥60岁者为(20.0±18.3)ng/L，两者比较差异有统计学意义(t=2.423，P<0.01)。

2.4 血清G-CSF水平与肿瘤组织学类型、分化程度及肿瘤大小的关系

2.4.1 血清G-CSF水平与肿瘤组织学类型的关系 大细胞癌患者的血清G-CSF水平为(137.9±20.4)ng/L、鳞癌患者为(37.5±24.0)ng/L、腺癌患者为(21.0±15.7)ng/L，3者比较差异有统计学意义(F=5.20，P<0.01)；且大细胞癌患者较鳞癌和腺癌患者均高，差异有统计学意义(t=2.97，10.00；均P<0.05)，鳞癌患者较腺癌患者高，差异有统计学意义(t=2.25，P<0.05，见图1)。

2.4.2 血清G-CSF水平与肿瘤分化程度的关系 肿瘤病理组织学分级，Ⅰ级高分化5例(10%)，Ⅱ级中分化15例(30%)，Ⅲ级未分化或低分化30例(60%)，其中Ⅲ级患者血清G-CSF水平为(42.8±33.7)ng/L、Ⅱ级为(23.58±17.3)ng/L、Ⅰ级为(5.4±5.4)ng/L，3者比较差异有统计学意义(F=5.45，P<0.01)；且Ⅲ级较Ⅰ级和Ⅱ级均高，差异有统计学意义(t=5.66，-2.64；均P<0.05)，Ⅱ级较Ⅰ级高，差异有统计学意义(t=2.98，P<0.01，见图2)。

2.4.3 血清G-CSF水平与肿瘤大小的关系 50例患者中最大的肿瘤直径为9 cm，最小为1 cm，中位数为3.5 cm，血清G-CSF水平的相关分析结果显示，血清G-CSF水平与肿瘤大小无相关性(r=0.174，P>0.05)。

2.5 血清G-CSF水平与淋巴结转移的关系 50例患者中有淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者31例，其中有淋巴结转移者的血清G-CSF水平为(45.0±21.3)ng/L，高于无淋巴结转移者(26.2.0±23.1)ng/L，差异有统计学意义(t=2.654，P<0.01)。

图1 血清G-CSF水平与肿瘤组织学类型的关系

Figure1 Relationship between serum G-CSF level and tumor histologic types

图2 血清G-CSF水平与肿瘤分化程度的关系

Figure2 Relationship between serum G-CSF level and the degree of tumor differentiation

3 讨论

目前有关G-CSF对肿瘤细胞作用机制尚不明确，肿瘤细胞分泌的G-CSF与肿瘤细胞的G-CSF受体相结合，通过自分泌方式促进了肿瘤细胞增殖、增强了肿瘤的侵袭性、增加了转移可能[3]。G-CSF还通过旁分泌方式作用于肿瘤间质，并通过影响、调节肿瘤间质诱导改变微环境来促进肿瘤进展。此外G-CSF还被认为可以直接或间接发挥免疫抑制的作用，从而导致该类肿瘤预后差[4]。

肺癌是可以分泌G-CSF的实体肿瘤中最常见的一种，本研究结果显示，术后血清G-CSF水平低于术前，手术前后血清G-CSF水平有差异。国内外均有报道发现NSCLC患者术后血清G-CSF水平下降[5-7]。可以认为，手术前后血清G-CSF水平有差异与术后肿瘤负荷降低、肿瘤细胞分泌G-CSF减少有关。本研究也证实白细胞计数及中性粒细胞计数在术后下降，考虑与术后肿瘤负荷降低、肿瘤细胞分泌G-CSF减少有关，从而引起中性粒细胞计数下降。因此，临床上对伴有G-CSF分泌的NSCLC患者，检测其外周血中性粒细胞计数水平和血清G-CSF水平可作为衡量其病情变化的一个指标。

本研究50例血清G-CSF水平测定显示，G-CSF水平在各组织学类型之间有差异，血清G-CSF水平与肿瘤组织学类型密切相关，大细胞癌患者血清G-CSF水平显著高于其他组织学类型，其次是鳞癌，腺癌最低。此研究结果与Takaoka等[2]研究结果一致，Takaoka等发现，产生G-CSF的肺癌中绝大部分是大细胞癌和鳞癌。Kasuga等[8]研究中通过免疫组化检测证实12例分泌G-CSF的肺癌组织细胞中，有3例是大细胞癌，4例鳞癌，5例腺癌，其中大细胞癌免疫组化染色强阳性，较其他组织类型染色更为明显。血清G-CSF水平与有无淋巴结转移密切相关，血清G-CSF水平高的NSCLC易于发生淋巴结转移，这与血清G-CSF水平高的NSCLC预后差、易转移的报道一致[9]。G-CSF增强了肿瘤的侵袭性、增加了转移可能。

通常判定一个肿瘤标记物的临床价值的因素有3个：(1)该肿瘤标记物在该肿瘤患者中的检出率，即敏感度；(2)此肿瘤标记物水平与肿瘤负荷的关系；(3)此肿瘤标记物反映临床治疗疗效程度。国外有研究报道G-CSF的灵敏度为66%，高于癌胚抗原(CEA)(62%)和细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)(51%)，有研究显示，血清G-CSF检测在以上方面有较好的体现[5]。结合本研究结果，G-CSF有可能作为一种新型肿瘤标记物应用于临床，其敏感度和特异度可能优于目前常用的传统标记物。对于临床证实伴有血清G-CSF水平增高的肿瘤患者，G-CSF有可能作为诊断、监测肿瘤是否复发和随访的标志。

综上所述，在选择使用外源性G-CSF治疗化疗引起的粒细胞减少症时应慎重，应当认真地重新评估G-CSF对实体肿瘤的促生长作用及用于肿瘤治疗的后果。由于目前有关肿瘤细胞分泌G-CSF的细胞和分子生物学机制尚不明确，还需要进一步深入研究，而与G-CSF相关的分子靶向治疗有可能成为治疗策略之一。

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