Citrin缺陷引起的新生儿肝内胆汁淤积症两例临床特点及家系基因分析

闫秀梅，黄开宇，李云芳，胡伟国，张春花，郑必霞，郭 惟

Citrin缺陷引起的新生儿肝内胆汁淤积症(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD)是SLC25A13基因突变导致位于线粒体内膜的载体蛋白Citrin功能不足而形成的一种遗传代谢病[1]。以黄疸、肝功能异常并伴有高瓜氨酸血症、高乳酸血症、高氨血症、半乳糖血症、酪氨酸血症、低蛋白血症等为主要临床表现[2]。其致病基因SLC25A13由日本鹿儿岛大学Kobayashi等[3]于1999年定位克隆，而临床患者则由Ohura等[4]和Tazawa等[5]在2001年最初报道，之后鹿儿岛大学又陆续检测出了巴勒斯坦、以色列、韩国、中国(包括台湾地区)、捷克、美国、英国等国家的患者。国内首例NICCD的确诊见于2006年[6]，近5年在我国已有100余例相关报道，但目前罕见该病家系基因表型分析报道。我科收治2例经基因检测确诊的NICCD患儿，并予家系基因分析，现报道如下。

1　病例简介

表1SLC25A13基因6个片段引物设计片段包含突变引物序列、退火温度及片段长度

Table1The six segment primer of SLC25A13 gene include the sequence of mutational primer，annealing temperature and the segment length

外显子　　　　　引物序列退火温度(℃)片段长度(bp)Exon6E：5′-TGAGGGCTTGTTAGATCAAGAT-3′F：5′-TTACCCAGACAACAAATTAACCT-3′60467Exon7E：5′-CATGATTAGTTGCAGTTGCT-3′F：5′-ATAGTTAATATGTGTCAATG-3′55447Exon8，9E：5′-TCACTCATTCCAGTGCCTTG-3′F：5′-CAATGCCGCAAAGGCAACTG-3′63556Exon10F：5′-ACCGTGCCTGGCCTCAGTGATG-3′R：5′-TTTACTCTTGCCCTACCCACA-3′62554Exon11E：5′-TTGGGCTGTAGCAATGTGCC-3′F：5′-CTAGATGCCTCCAGCCTACT-3′63557Exon13E：5′-CTCCTGAAACATCAGTGATGC-3′F：5′-CCTAGTAGACTCTGCCCTTG-3′61433Exon16，17E：5′-GAGAATGTGACCAGACTGAGAT-3′F：5′-CTTTCCCTACGACAACAGAGCA-3′60453

注：a=杂合突变[Ⅰ]851del4;b=杂合突变[Ⅱ]IVS11+IG>A

图1杂合突变[Ⅰ]851del4和杂合突变[Ⅱ]IVS11+IG>A

Figure1Heterozygous mutation[Ⅰ]851del4 and[Ⅱ]IVS11+IG>A

例1：女，出生42 d。温州人，生后混合喂养。母孕史无异常，足月剖宫产，出生体质量2.7 kg。父母均系温州人，体健。两系三代否认家族性及遗传性疾病。此次因“腹泻半个月，皮肤黄染3 d”于2010-07-04入住我科。入院查体：皮肤苍黄，巩膜轻度黄染，心前区Ⅲ级收缩期杂音，腹平软，肝肋下1.5 cm，剑突下1 cm，质软，边锐，余无异常。实验室检查：转氨酶升高，胆红素双向升高，血常规提示中度贫血，凝血功能基本正常，甲胎蛋白明显升高。

例2：男，出生95 d。温州人，生后配方奶粉喂养。母孕史无异常，孕1产1，足月顺产，出生体质量3.0 kg。父母系温州泰顺人，体健。两系三代否认家族性及遗传性疾病。因“皮肤、巩膜黄染3个月，发现肝功能异常1 d”于2012-02-12收住我科。入院查体：皮肤、巩膜中度黄染，腹软，肝肋下5.0 cm，剑突下0.5 cm，质软，边锐，余无异常。入院后查血常规提示轻度贫血，肝功能提示丙氨酸氨基转移酶轻度升高，胆红素双向升高，以直接胆红素升高为主，凝血功能正常，甲胎蛋白明显升高。

2　基因检测方法

2.1DNA提取剪取0.5 mm×0.5 mm大小血片样，用DNA IQTMSystem-Small Sample Casework Kit(Promega Corporation，USA)抽提基因组DNA，操作步骤严格按照试剂盒protocol。

2.2聚合酶链式反应(PCR)扩增根据文献中报道的12种已知突变在基因上的分布位置[7]，将其所在区域分成6个片段扩增，应用引物设计软件Primer5分别为6个片段设计引物，由Invitrogen(英骏)公司合成。引物设计见表1。

PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环后，72 ℃延伸10 min。

2.3抽提PCR产物用TIANGEN凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN BIOTECH CO.LTD，BEIJING)抽提PCR产物。

2.4DNA序列测定及分析以BigDye Terminator(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行产物标记，精制纯化后用ABI Prism 3100 genetic analyzer(Applied Biosystems)测序。测序结果与正常序列进行BLAST比较。

3　诊断结果与治疗措施

例1结果：尿代谢检查高度提示酪氨酸血症或Citrin缺陷症。抽取患儿及其父母外周血提取基因组DNA，对SLC25A13基因行PCR和产物测序，结果与参考序列比对，分析表明患儿基因型：851del4/851del4纯合突变，患儿父亲基因型：851del4/——携带者，母亲基因型：851del4/——携带者。治疗：食用无乳糖和加强中链脂肪酸的配方奶粉，补充多种脂溶性维生素，熊去氧胆酸改善胆汁淤积。随访2.5个月，患儿黄疸消退，血生化基本恢复正常。现患儿2周岁，生长发育良好，无黄疸。

例2结果：尿代谢结果提示半乳糖血症以及Citrin缺陷症待除外。抽取患儿及其父母外周血提取基因组DNA，对SLC25A13基因行PCR和产物测序，结果与参考序列比对，分析表明患儿基因型：[Ⅰ]851del4/[Ⅱ]IVS11+IG>A的复合变异，患儿父亲基因型：[Ⅱ]IVS11+IG>A/——携带者，母亲基因型：[Ⅰ]851del4/——携带者(见图1)。治疗：食用无乳糖和加强中链脂肪酸的配方奶粉，补充多种脂溶性维生素，熊去氧胆酸改善胆汁淤积。随访1个月，肝功能正常。现患儿1岁，生长发育良好。

4　讨论

NICCD的致病基因SLC25A13位于染色体7q21.3，包含18个外显子，长200 kb，编码一种线粒体内钙结合天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白Citrin。SLC25A13基因突变所导致的Citrin缺陷症在儿童期表现为肝内胆汁淤积症和黄疸，称为NICCD[8]；而在成人期表现为高氨血症、突发的意识障碍、精神错乱等神经系统症状，称为成年发病的Ⅱ型瓜氨酸血症(adult onset type Ⅱ citrullinemia，CTLN2)。NICCD在遗传代谢病高危患者中阳性率居第2位，仅次于甲基丙二酸血症[9]。在临床实践中随着NICCD患儿数的不断增加，该病日益受到临床医生的重视。NICCD患儿目前尚缺乏成熟的临床或者生化诊断标准，所以现阶段应当强调SLC25A13基因诊断的必要性。截至2012年4月，日本鹿儿岛大学Kobayashi领导的课题组已经发现了SLC25A13基因的54种突变类型，包括13种无义，17种错义，5种插入，5种缺失，14种剪切突变。已发表的突变类型中有12种被作为分子流行病学常规筛查手段，结果显示851del4和IVS11+lG>A在日本人中常见，而851del4、1638ins23和IVS6+5G>A则在中国人中多见[10]。我国NICCD诊断治疗研究起步较晚，尚缺乏大样本、多中心的分子流行病学调查结论。本研究2例患儿均为温州籍人，突变类型分别为851del4、[Ⅰ]851de14/[Ⅱ]IVS11+lG>A，与以往文献报道稍有不符。

本研究2例患儿均表现黄疸、肝大等症状，实验室检查均有高胆红素血症、肝功能异常、甲胎蛋白明显升高、贫血以及血氨升高等改变。天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶的升高提示患儿肝细胞有不同程度受损，高胆红素血症和碱性磷酸酶升高提示患儿存在胆汁淤积。NICCD是一种在亚洲地区较为常见的遗传代谢病，以往研究认为NICCD患儿可通过代偿适应使其临床症状于1岁左右自行缓解。Ohura等[11]对75例NICCD患儿的回顾性研究发现，仅2例患儿肝功能持续恶化并分别于5个月和10个月行肝移植术。本研究2例患儿均预后良好。虽然NICCD多数可自行缓解，但严重者可出现多种并发症如营养不良、生长发育障碍、白内障、凝血功能障碍甚至肝衰竭，部分可转化为CTLN2[12]，预后不良，故早期诊断NICCD是非常重要的。第一，可以对新生儿进行筛查早期诊断，Ohura等[11]通过临床回顾性分析发现，日本诊断的NICCD患者约40%是在新生儿筛查中发现异常指标；第二，对有家族史的高危胎儿进行胎内诊断[13]；第三，对患胆汁淤积性肝病的患儿早做出NICCD的诊断。鉴于NICCD临床表现及实验室检查无特异性，且为一过性，患者往往在4～6个月龄后逐渐恢复正常，有学者强烈建议相关的检查应尽可能在4个月龄前进行[14]，包括临床生化、尿气相色谱氨基酸(GC-MS)分析、血串联质谱(MS-MS)分析筛查，确诊有赖于SLC25A13突变基因检测，如基因检测与Citrin蛋白检测相结合，可以有效弥补基因分析的不足之处，更有利于疾病诊断。NICCD治疗以饮食控制为主。NICCD患儿通过停止母乳喂养，改换无乳糖和强化中链脂肪酸的特殊配方奶粉，并补充多种脂溶性维生素，症状可获改善。虽然一些NICCD患儿未经过特殊治疗临床表现也渐缓解，但亦有NICCD 患儿病情严重而不得不接受肝脏移植，甚至夭折[15-16]。

近来国内儿科界对于此病的临床表现和实验室检查异常开始有一定的认识，北京、上海和广州等中心城市的部分医院也陆续成功诊断NICCD患儿，但是从总体上讲，本病诊治知识的推广普及还需进一步加强，分子遗传学领域的研究开展还不多，所发现的SLC25A13基因突变种类尤其是新突变种类还相当有限。因此，我国医学界同仁应当加强协作，积极开展SLC25A13基因突变研究，建立相应的分子诊断方法，更快更好地服务广大NICCD患者。

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