C反应蛋白基因多态性及环境因素交互作用与中国人群缺血性脑卒中的关联研究

李继来，陈忠云，李晓峰，李 婧，杜继臣，杨 旭

缺血性脑卒中(IS)是由遗传和环境等多种因素共同作用导致的一种多因素疾病[1]。传统的危险因素如年龄、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟等很难完全解释疾病的发生、发展过程。研究表明，动脉粥样硬化(AS)作为一种导致IS的主要病因，被认为是一种炎性疾病[2-3]。C反应蛋白(CRP)作为一种参与全身炎症反应的炎性标志物[4]，参与了AS的发生、发展，能够反映AS斑块中的炎症活动水平[5-7]，对IS的发病、严重程度及预后等有重要的预测价值[8-12]，可以作为预测老年人IS发病的标记物。已有研究表明，CRP基因一些单核苷酸多态性(SNP)位点与IS密切相关[13-14]，但亦有争议[15-16]。基于此，本研究拟采用基于中国汉族人群的病例对照研究，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，观察汉族IS患者和健康人群的基因多态性分布，探讨CRP基因两个SNP(rs1800947和rs3093059)位点与IS及其亚型的相关性,并进一步研究CRP基因多态性与环境因素的交互作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2010年10月—2011年12月连续收集入住航天中心医院神经内科的IS患者159例为病例组，其中男112例，女47例；平均年龄(65.4±8.2)岁。所有患者为发病5 d内入选，IS诊断符合世界卫生组织(WHO)卒中诊断标准。排除以下疾病：脑肿瘤、脑血管畸形、代谢性疾病(糖尿病除外)、感染、自身免疫性疾病、血液系统疾病、肿瘤和严重的慢性疾病(如肝、肾功能不全等)。同期从体检中心随机选取年龄、性别与病例组相匹配的健康者175例为对照组,其中男106例，女69例；平均年龄(65.8±8.6)岁。根据临床分析和实验室评估，按照病例组的筛选标准，同样排除上述的脑肿瘤等疾病。所有受试者互不相关且均来自北京。本研究经当地伦理协会和医院伦理委员会审查批准。所有患者签署知情同意书。

1.2 资料收集 由同一位医生对每例患者及对照者采用统一的调查问卷和询问方式，包括现病史和既往史、体格检查、实验室检查以及个人史〔体质指数(BMI)、高血压史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史、饮酒史和脑卒中家族史〕等。对所有患者行颅脑磁共振成像(MRI)和(或)颅脑CT、心脏超声、颈外动脉双重成像以及实验室检查，必要时行磁共振血管造影(MRA)以及多普勒超声心动图(PDE)。根据TOAST(the Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment)分型，排除其他病因引发的IS以及原因不明的IS，把病例组分为大动脉粥样硬化(LAA)组、小动脉阻塞(SAA)组、心源性栓塞(CE)组。

1.3 定义 BMI=体质量(kg)/身高2(m2)，BMI≥25 kg/m2为肥胖和(或)超重。高血压指收缩压≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90 mm Hg，或者接受高血压药物治疗。糖尿病指有糖尿病的相关临床症状，并且1 d当中任意时候血糖水平≥11.1 mmol/L，或空腹至少8 h后，血糖水平≥7.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)2 h血糖水平≥11.1 mmol/L。冠心病指既往有明确的心绞痛史、心肌梗死史。吸烟史指5年内至少每天吸烟10支。饮酒史指平均每天饮白酒2两以上，连续5年以上。脑卒中家族史指至少一个一级直系亲属曾患脑梗死。

1.4 基因多态性分析

1.4.1 DNA提取 IS患者入院次日及对照组受检者体检当日清晨采集空腹肘静脉血2 ml(EDTA抗凝)，用盐析法[17]提取外周血白细胞中基因组DNA，-80 ℃冰箱冻存备用。

1.4.2 标签SNP选择 以NCBI SNP数据库中中国汉族人群的数据为基础，选择最小等位基因频率(MAF)>18%的SNP或者已被报道的SNP为研究目标位点，最终选择了位于第二外显子区的rs1800947和启动子区的rs3093059。

1.4.3 引物设计及基因型的测定 应用Premier 5.0软件自行设计CRP rs1800947和rs3093059引物，并经GENEBANK中BLAST分析其特异性高，由上海英俊生物技术有限公司合成。(1)PCR反应体系：20 μl反应体系包括上下游引物各4 pmol，基因组DNA(盐析法提取) 10 ng，2×PCR Mix〔天根生化科技(北京)有限公司，货号：KT201〕10 μl，加水补足反应体系。(2)PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25个循环，最后72 ℃延伸7 min。反应结束后，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像分析系统观察PCR扩增结果。(3)酶切与电泳：取PCR扩增产物10 μl，加入限制性内切酶10 U和2 μl内切酶缓冲液混合，温育过夜。以2%琼脂糖凝胶对PCR酶切产物进行电泳检测，溴化乙锭0.5 mg/L染色，电泳缓冲液为0.5倍Tris-硼酸缓冲液(0.5×TBE)，选择电泳电压100 V(5 V/cm)，在紫外分析仪上观察结果并照相，根据电泳后见到的条带分析基因型(见表1)。

1.4.4 基因分析 rs1800947经PCR扩增后产生663 bp片段，rs1800947 CC基因型者无Tsp45I酶切位点，酶切图谱只见663 bp 1条带；GG基因型者两等位基因序列都发生G>C突变，出现Tsp45I酶切位点，酶切图谱可见530 bp、104 bp 2条带；GC杂合基因型者可见663 bp、530 bp、104 bp 3条带，测序结果证实此位点发生G>C置换。rs3093059基因的PCR扩增产物片段长度为285 bp，扩增片段内另有一个酶切位点。TT基因型(野生型)的扩增产物可被完全切断，主要可见178 bp、64 bp、53 bp 3种片段；TC基因型为杂合子，可见242 bp、178 bp、64 bp、53 bp 4种片段；CC基因型(突变纯合子)不能被酶切断，可见242 bp和53 bp 2种片段。测序结果证实此位点发生T>C置换。

2 结果

2.1 病例组与对照组临床资料比较 病例组较对照组冠心病史、高血压史、糖尿病史、BMI≥25 kg/m2、吸烟史、饮酒史的检出率增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组年龄、性别、三酰甘油、总胆固醇水平及脑卒中家族史比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表1 CRP基因引物序列、内切酶和酶切片段长度

表2 对照组与病例组临床资料比较

注：BMI=体质指数

2.2 病例组与对照组基因型和等位基因比较 rs1800947和rs3093059的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。一般人群中以上基因位点各等位基因已经达到遗传平衡，具有较好的人群代表性。

Logistic回归校正相关混杂因素(性别、BMI、高血压史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史、饮酒史和脑卒中家族史)后，病例组与对照组rs1800947 GG和GC基因型分布比较，差异有统计学意义〔OR=3.456，95%CI(1.350，8.845)，P=0.010〕。病例组与对照组rs1800947 G和C等位基因分布比较，差异有统计学意义〔OR=3.069，95%CI(1.237，7.612)，P=0.016〕。rs3093059基因型和等位基因分布与IS无相关性(见表3)。

Logistic回归校正相关混杂因素后，rs1800947 GC基因型与SAA的发生有统计学关联〔OR=6.225，95%CI(1.739，22.291)，P=0.005〕；rs3093059基因型与IS亚型无相关性(见表4)。

2.3 rs1800947与环境因素的交互作用 与rs1800947 GG基因型且无吸烟史、饮酒史的个体相比，rs1800947 GC基因型且有吸烟史以及饮酒史的个体患IS的风险上升，校正相关危险因素后，OR值分别为6.667和11.110(见表5)。

表3 对照组与病例组rs1800947和rs3093059基因型和等位基因比较(例)

注：*多元Logistic回归校正性别、BMI、高血压史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史、饮酒史和脑卒中家族史

表4 病例组不同亚型与对照组rs1800947和rs3093059基因型和等位基因比较(例)

注：LAA=大动脉粥样硬化，SAA=小动脉阻塞，CE=心源性栓塞;*多元Logistic回归校正性别、BMI、高血压史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史、饮酒史和脑卒中家族史

表5 rs1800947与环境因素的交互作用分析(例)

注：*多元Logistic回归校正性别、BMI、高血压史、糖尿病史、冠心病史以及脑卒中家族史

3 讨论

炎症机制参与了动脉粥样硬化疾病诸如心脑血管疾病的发生发展[18-20]，CRP作为炎性标志物其血清水平能够有效预测心血管事件的发生。研究表明，血清CRP水平升高是IS的独立危险因素[18-20]。在影响血清CRP水平的因素中，遗传因素发挥了39%～52%的作用[21-23]，因此进一步对CRP基因SNP的研究有着重要的意义。

本研究结果显示，rs1800947 G、C等位基因分布有差异，表明携带rs1800947等位基因C的个体患IS的可能性更大。经多元Logistic回归校正相关危险因素后，与GG基因型相比，rs1800947 GC基因型增加了IS的发病风险。日本Morita等[24]对152例IS患者和304例老年正常人群进行研究，使用TaqMan探针对CRP基因rs1800947进行基因分型，校正相关危险因素后发现，相对rs1800947的GG基因型而言，GC是IS的独立危险因素〔95%CI(1.3，10.9)，P=0.016〕，本研究结果与其报道一致。但Ladenvall等[14]在2006年对瑞典600例IS患者和600例正常对照者进行的病例对照研究，运用TaqMan探针对CRP基因进行基因分型，结果却未发现IS与rs1800947基因型具有相关性〔OR=1.14，95%CI(0.81，1.61)〕。国内Liu等[16]在2008年应用PCR-RFLP检测222例IS/TIA患者(122例单纯颅内动脉粥样硬化病变者和100例单纯颅外动脉粥样硬化病变者)及227例对照组的CRP基因rs1800947进行基因分型，结果提示IS/TIA组与对照组的rs1800947基因型及等位基因频率均无差异。可以看出，rs1800947 SNP与IS风险的相关性研究尚有争议。

本研究中未发现rs3093059基因型与IS发病风险间有关联。一项来自美国国家心肺血液研究院(NHLBI)以家庭为基础的大型横断面研究利用焦磷酸测序技术对1 296例高加索人CRP基因rs3093059进行基因型分析，结果亦未发现rs3093059与心血管疾病之间存在关联[15]。国内Shen等[25]对584例中国IS患者与993例相匹配的对照者进行的一项病例对照研究，结果表明rs3093059与IS间存在相关性，rs3093059的加性模型、显性模型以及等位基因频率分布的OR值及95%CI分别为0.697(0.528，0.921)、0.671(0.487，0.923)、0.811(0.666，0.988)。这些有争议的结果可能是由于种族、样本量以及研究设计方法的不同所致。

本研究结果显示，CRP基因中的rs1800947 GC基因型与SAA有关，而与LAA及CE无关，这与德国的Kuhlenbaeumer等[26]研究相一致。SAA主要由腔隙性脑梗死和脑白质疏松等构成。腔隙性脑梗死被认为是由小穿支动脉的脂质透明样变性和微细血管硬化，由于原位血栓形成所造成；而脑白质疏松的发病机制有待阐明。SAA的发病机制主要为血液运输管道的结构改变、血管舒缩调节障碍[27]、血-脑脊液屏障功能破坏[28]以及细胞间液重吸收障碍[29]。有研究表明，在SAA中发现炎性内皮细胞的激活以及内皮功能的紊乱。发生机制可能是CRP作为一种急性炎性时相反应指标，可诱导内皮细胞黏附分子的产生[30-31]，通过受体介导的趋化反应募集单核细胞[32-33]，诱导单核细胞产生组织因子[34]，进而促进内皮细胞损伤，引起SAA。然而，先前的一些研究并未显示CRP基因的遗传变异与SAA有关[35-36]。

本研究进一步评价这两个SNP位点及环境因素的交互作用与IS的相关性。结果发现，吸烟状态与rs1800947 GC基因型，饮酒状态与rs1800947 GC基因型之间存在交互作用。与rs1800947 GG基因型且无吸烟史、饮酒史的个体相比，rs1800947 GC基因型且有吸烟史、饮酒史的个体患IS的风险上升，提示GC基因型与吸烟、饮酒的交互作用在IS的发生效应上有放大作用。国外学者Humphries等[37]提出，吸烟可能通过内皮细胞分泌细胞核的转录因子并刺激肝细胞合成CRP，CRP可作用于内皮细胞，诱导黏附分子的表达，引起血液中的一些炎性细胞移行至内皮下，并释放一些炎性递质从而进一步损伤内皮功能[38]。饮酒与炎性反应的并存可能通过改变血液凝固和纤维蛋白溶解等机制而增加IS的易患性。

综上所述，CRP基因rs1800947 GC基因型参与了IS及其SAA的发生，并发现其与吸烟、饮酒间存在交互作用。CRP基因rs1800947位点的多态性为IS的危险因素提供了新的证据。本研究为病例对照研究，样本量较小，需要谨慎分析结果，可进一步行大样本及高质量前瞻性研究论证。

1 Flossmann E,Schulz UG,Rothwell PM.Systematic review of methods and results of studies of the genetic epidemiology of ischemic stroke[J].Stroke，2004,35(1):212-227.

2 Libby P.Inflammation in atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012，32(9):2045-2051.

3 Chamorro A.Role of inflammation in stroke and atherothrombosis[J].J Stroke Cerebrovasc Dis，2004,17(Suppl 3):1-5.

4 Gabay C,Kushner I.Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation[J].New England Journal of Medicine，1999,340(6):448-454.

5 Van Der Meer IM,De Maat MP,Hak AE,et al.C-reactive protein predicts progression of atherosclerosis measured at various sites in the arterial tree:the Rotterdam Study[J].Stroke，2002,33(12):2750-2755.

6 Danesh J,Collins R,Appleby P,et al.Association of fibrinogen,C-reactive protein,albumin,or leukocyte count with coronary heart disease:meta-analyses of prospective studies[J].JAMA，1998,279(18):1477-1482.

7 Wilson PW.Metabolic risk factors for coronary heart disease:current and future prospects[J].Current Opinion in Cardiology，1999,14(2):176.

8 Kaptoge S,Di Angelantonio E,Lowe G,et al.C-reactive protein concentration and risk of coronary heart disease,stroke,and mortality:an individual participant meta-analysis[J].Lancet，2010,375(9709):132-140.

9 Andersson J,Johansson L,Ladenvall P,et al.C-reactive protein is a determinant of first-ever stroke:prospective nested case-referent study[J].Cerebrovascular Diseases，2009,27(6):544-551.

10 Rost NS,Wolf PA,Kase CS,et al.Plasma concentration of C-reactive protein and risk of ischemic stroke and transient ischemic attack[J].Stroke，2001,32(11):2575-2579.

11 Arenillas JF,Alvarez-Sabin J,Molina CA,et al.C-reactive protein predicts further ischemic events in first-ever transient ischemic attack or stroke patients with intracranial large-artery occlusive disease[J].Stroke,2003,34(10):2463-2468.

12 Di Napoli M,Schwaninger M,Cappelli R,et al.Evaluation of C-reactive protein measurement for assessing the risk and prognosis in ischemic stroke[J].Stroke，2005,36(6):1316-1329.

13 Wang Q,Ding H,Tang JR,et al.C-reactive protein polymorphisms and genetic susceptibility to ischemic stroke and hemorrhagic stroke in the Chinese Han population[J].Acta Pharmacol Sin，2009,30(3):291-298.

14 Ladenvall C,Jood K,Blomstrand C,et al.Serum C-reactive protein concentration and genotype in relation to ischemic stroke subtype[J].Stroke，2006,37(8):2018-2023.

15 Wang Q,Hunt SC,Xu Q,et al.Association study of CRP gene polymorphisms with serum CRP level and cardiovascular risk in the NHLBI Family Heart Study[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006,291(6):H2752-H2757.

16 Liu ZZ,Lv H,Gao F,et al.Polymorphism in the human C-reactive protein (CRP) gene,serum concentrations of CRP,and the difference between intracranial and extracranial atherosclerosis[J].Clin Chim Acta，2008,389(1/2):40-44.

17 Miller SA,Dykes DD,Polesky HF.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J].Nucleic Acids Res,1988,16(3):1215.

18 Tanne D,Benderly M,Goldbourt U,et al.C-reactive protein as a predictor of incident ischemic stroke among patients with preexisting cardiovascular disease[J].Stroke,2006,37(7):1720-1724.

19 Yoldas T,Gonen M,Godekmerdan A,et al.The serum high-sensitive C reactive protein and homocysteine levels to evaluate the prognosis of acute ischemic stroke[J].Mediators Inflamm,2007,2007:15929.

20 Corso G,Bottacchi E,Brusa A,et al.Is there a prognostic role for C-reactive protein in ischemic stroke?[J].Acta Neurol Scand,2009,122(3):209-216.

21 Pankow JS,Folsom AR,Cushman M,et al.Familial and genetic determinants of systemic markers of inflammation:the NHLBI family heart study[J].Atherosclerosis,2001,154(3):681-689.

22 Vickers MA,Green FR,Terry C,et al.Genotype at a promoter polymorphism of the interleukin-6 gene is associated with baseline levels of plasma C-reactive protein[J].Cardiovasc Res,2002,53(4):1029-1034.

23 MacGregor AJ,Gallimore JR,Spector TD,et al.Genetic effects on baseline values of C-reactive protein and serum amyloid a protein:a comparison of monozygotic and dizygotic twins[J].Clin Chem,2004,50(1):130-134.

24 Morita A,Nakayama T,Soma M.Association study between C-reactive protein genes and ischemic stroke in Japanese subjects[J].Am J Hypertens,2006,19(6):593-600.

25 Shen C,Sun X,Wang H,et al.Association study of CRP gene and ischemic stroke in a Chinese Han population[J].J Mol Neurosci,2013,49(3):559-566.

26 Kuhlenbaeumer G,Huge A,Berger K,et al.Genetic variants in the C-reactive protein gene are associated with microangiopathic ischemic stroke[J].Cerebrovasc Dis,2010,30(5):476-482.

27 Molina C,Sabin JA,Montaner J,et al.Impaired cerebrovascular reactivity as a risk marker for first-ever lacunar infarction:A case-control study[J].Stroke,1999,30(11):2296-2301.

28 Wardlaw JM,Dennis MS,Warlow CP,et al.Imaging appearance of the symptomatic perforating artery in patients with lacunar infarction:occlusion or other vascular pathology?[J].Ann Neurol,2001,50(2):208-215.

29 Roher AE,Kuo YM,Esh C,et al.Cortical and leptomeningeal cerebrovascular amyloid and white matter pathology in Alzheimer′s disease[J].Mol Med,2003,9(3/4):112-122.

30 Chen C,Nan B,Lin P,et al.C-reactive protein increases plasminogen activator inhibitor-1 expression in human endothelial cells[J].Thromb Res,2008,122(1):125-133.

31 Han C,Liu J,Liu X,et al.Angiotensin Ⅱ induces C-reactive protein expression through ERK1/2 and JNK signaling in human aortic endothelial cells[J].Atherosclerosis,2010,212(1):206-212.

32 Huang X,Zhang J,Liu J,et al.C-reactive protein promotes adhesion of monocytes to endothelial cells via NADPH oxidase-mediated oxidative stress[J].J Cell Biochem,2012,113(3):857-867.

33 Inoue N.Vascular C-reactive protein in the pathogenesis of coronary artery disease:role of vascular inflammation and oxidative stress[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2006,6(4):227-231.

34 Cermak J,Key NS,Bach RR,et al.C-reactive protein induces human peripheral blood monocytes to synthesize tissue factor[J].Blood,1993,82(2):513-520.

35 Schmidt R,Schmidt H,Pichler M,et al.C-reactive protein,carotid atherosclerosis,and cerebral small-vessel disease:results of the Austrian Stroke Prevention Study[J].Stroke,2006,37(12):2910-2916.

36 Di Napoli M,Papa F.C-reactive protein and cerebral small-vessel disease:an opportunity to reassess small-vessel disease physiopathology?[J].Circulation,2005,112(6):781-785.

37 Humphries SE,Luong LA,Montgomery HE,et al.Gene-environment interaction in the determination of levels of plasma fibrinogen[J].Thromb Haemost,1999,82(2):818-825.

38 Pasceri V,Willerson JT,Yeh ET.Direct proinflammatory effect of C-reactive protein on human endothelial cells[J].Circulation,2000,102(18):2165-2168.