支原体肺炎患儿肺泡表面活性物质蛋白A基因多态性研究

许明峰，冯罗华，潘乐英，吴 晔

支原体肺炎(MP)是肺炎支原体引起的一种间质性肺炎，常见于5岁以上儿童，近年来其发病率呈不断上升趋势[1-2]，且多见婴幼儿感染。肺泡表面活性物质相关蛋白(SP)是由肺泡2型细胞分泌产生的[3]，其中肺泡表面活性物质蛋白A(SP-A)是目前研究最多的一种，其作为生物学标志在肺部疾病中有着重要意义[4]。本研究通过检测MP患儿及非MP患儿的血样，测定SP-A基因序列，比较rs1059054、rs1136452及rs1136454位点的基因多态性，旨在探讨SP-A基因多态性与MP患儿易感性的关系，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2011年1—12月在我院住院的MP患儿100例为病例组，其中男58例，女42例；年龄6个月～14周岁；诊断依据卫生部2009年版儿科临床路径中儿童MP临床路径：临床症状及胸部X线片、胸部CT检查诊断为肺炎，咽拭子肺炎支原体分离培养阳性，痰培养无其他细菌生长。选择同期在我院住院的非MP患儿100例为对照组，其中男63例，女37例；年龄13个月～14周岁；咽拭子肺炎支原体分离培养均为阴性，痰培养有或无其他细菌生长。

1.2方法

1.2.1标本采集两组患儿入院明确诊断后抽取血液标本，柠檬酸钠抗凝，采用Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，-70 ℃保存备用；试剂盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2.2聚合酶链反应(PCR)rs1059054位点上游引物为CTGGAGCCCCTGGTATCCCTGGAGAG，下游引物为GTGGAGAGAAGGGGGAGCCTGGCGA；rs1136452位点上游引物为CTGGAGAGTGTGGAGAGAAGGGGGAG，下游引物为CTGGCGAGAGGGGCCCTCCAGGTGA；rs1136454位点上游引物为GGAGAGAAGGGGGAGCCTGGCGAGAG，下游引物为GGCCCTCCAGGTGAGCAGGGTGGGG。引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以基因组DNA为模板在50 μl体系内进行聚合酶链反应(PCR)，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，循环35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。

1.3统计学方法应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，基因频率使用直接计数法统计；Hardy-Weinberg平衡的符合程度和基因型分布的比较采用χ2检验；等位基因分布采用优势比(OR)及其95%可信区间(CI)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SP-A基因突变位点测序结果+186位点共计220个碱基对，病例组rs1059054、rs1136452及rs1136454位点变异频率较高：rs1059054位点表现为纯合子CC、纯合子TT及杂合子CT(见图1A)；rs1136452位点表现为纯合子CC、纯合子GG及杂合子CG(见图1B)；rs1136454位点表现为纯合子AA、纯合子GG及杂合子AG(见图1C)。

2.2Hardy-Weinberg遗传平衡检验对照组和病例组rs1059054、rs1136452及rs1136454位点基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，具有群体代表性(见表1)。

2.3SP-A基因型分布两组rs1059054位点CC、CT、TT基因型分布及C、T等位基因分布比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组rs1136452位点CC、CG、GG基因型分布及C、G等位基因分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；两组rs1136454位点AA、AG、GG基因型分布及A、G等位基因分布比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

注：A为rs1059054位点，B为rs1136452位点，C为rs1136454位点

图1SP-A基因突变位点测序图

Figure1Mutations of the SP-A gene sequencing graph

表1　两组rs1059054、rs1136452及rs1136454位点基因型分布的Hardy-Weinberg平衡(例)

表2　SP-A基因型分布及等位基因分布(例)

注：*为χ2值

3　讨论

肺炎支原体是一种常见的儿童呼吸道感染病原体，MP多见于学龄儿童，常年均有发病，临床表现多样，除肺部症状外，可表现为多种肺外表现[5]。本研究中病例组患儿出现较多的肺外表现有心肌损害、胸膜炎、皮疹及肝功能损害等，且婴幼儿患儿例数明显增多，有15例患儿年龄<3周岁，年龄最小者仅6个月。MP因其反复性、病程长、肺外并发症多等而使患儿病情更加复杂，早期诊断和治疗尤其重要。临床一般通过测定肺炎支原体抗体和支原体培养以明确诊断，但支原体抗体一般在发病后1周阳性率才较高、1～4周为高峰期。本研究选用咽拭子肺炎支原体分离培养结果作为诊断依据，具有快速、早期发现率高的优点，其快速鉴定培养基为一种人工合成液体培养介质，组成材料是肺炎支原体结构繁殖所需的蛋白质、磷脂、碳水化合物、胆固醇、微量元素及复合抑菌因子等混合而成，营养丰富、特异性强，作用机制是快速繁殖增长的肺炎支原体分解葡萄糖产酸使培养基pH降低，产生颜色变化来判断肺炎支原体生长，血样中其他细菌则因培养基中加入了青霉素、醋酸铊和生物抑菌剂等而被抑制[6]。MP的治疗现在通用的为大环内酯类抗生素，但关于其治疗的疗程并无定论，疗程不足存在病情反复风险，而疗程过长存在肝功能损伤、消化系统反应等不良反应，给患儿及其家长带来了痛苦。

SP存在于肺泡表面，约占肺泡表面活性物质(PS)的10%，其余90%为脂类及磷脂[7]。SP除能降低肺泡表面张力外，还起着介导宿主防御及炎症反应等作用，其中以SP-A表达最强烈，且信号最丰富，在调节肺表面活性物质代谢[8-9]、基因表达、肺内免疫及炎症反应方面具有十分重要的作用[10]，而SP-A的表达水平与某些肺部疾病直接相关[11-12]，很多学者在肺部疾病中探讨过SP-A作为生物学标志的意义[13]。目前，临床上可以通过检测血液、肺泡灌洗液、痰液中SP-A水平指导临床诊治及判断预后，具有非常重要的意义。

在SP-A基因中有许多突变位点，最常见的位点为+186、+655、+667位点。本研究对+186位点(引物序列为F:TTTTCTCTGCAGGCCCCATGGGTGC；R:GGGTTTGTCTGATCCCCATC)测序后，得到220个碱基对序列，再仔细阅读发现变异频率较多的位点分别为rs1059054、rs1136452及rs1136454。统计学分析结果显示，病例组与对照组rs1059054、rs1136454位点基因型及等位基因的分布存在差异，而rs1136452位点则无差异，初步证明SP-A基因rs1059054、rs1136454位点的多态性与MP的发病有一定相关性，但这两个位点所表达的蛋白及其突变如何影响蛋白的表达仍需进一步探索。

综上所述，SP-A与许多肺部疾病密切相关，肺泡灌洗液中SP-A的水平检测可作为判断肺炎病情轻重程度的指标，并可作为临床上使用PS制剂替代疗法的理论依据；患儿SP-A基因多态性可能与MP的发病有关。但由于现在市场上PS制剂价格昂贵，暂时不可能作为治疗重症MP患儿的常规手段，距离临床推广应用还存在一定差距。同时由于技术原因，本研究未能对患儿肺泡灌洗液及肺泡SP-A水平进行定量分析或设置对照，有待于在今后的研究中进一步深入探索。

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