镇籼232的抗飞虱特性与育种利用

曾生元， 龚红兵， 李 闯， 林添资， 景德道， 盛生兰

(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400)

稻飞虱是亚洲稻区的主要害虫之一，对其防治主要依赖于高效化学杀虫剂的使用，这对防治稻飞虱虽然起到了一定作用，但长期使用杀虫剂导致飞虱的抗药性增强、天敌减少、飞虱再猖獗，另外，化学药剂的过度使用还会造成严重的环境污染。利用寄主抗性培育抗飞虱品种被认为是防治其危害最经济、有效的途径，因此，水稻育种家们努力寻找稻飞虱抗源，以期培育抗虫品种。

近年来，水稻抗褐飞虱基因(主效基因)的发掘、定位及克隆工作取得了较大进展，目前已鉴定的抗褐飞虱基因超过30个［1］，多个抗褐飞虱基因已经被精细定位，其中Bph14及Bph18基因已成功克隆［2］;有8个有白背飞虱基因［3］及少数几个抗灰飞虱基因［4］也已被定位。然而，目前鉴定的抗源大多数为野生稻和印度次大陆及东南亚的农家品种，其本身的综合农艺性状差，将有利抗性基因转育到当前品种中所需周期较长;此外，从原始材料鉴定、定位及进一步精细定位一个抗飞虱基因所需周期也较长，例如对Bph14基因的克隆耗时14年［5］;而飞虱种群的生物型变异丰富，单个基因的抗性易随飞虱生物型的变化而逐渐消失。因此，从推广品种中寻找综合抗性好的材料并将其中的抗性基因采用分子标记辅助选择导入目标品种，结合田间抗性鉴定培育抗性品种具有重要的实践价值。

此前的抗性鉴定初步表明，籼稻品种镇籼232是高抗褐飞虱品种，其对白背飞虱及灰飞虱的发生也具有抑制作用，综合性状优良［6］。为了探明镇籼232对稻飞虱的抗性特性，我们对镇籼232进行了稻飞虱抗性鉴定，构建镇籼232/武育粳3号F2群体，检测、分析其与褐飞虱抗性相关的基因位点，并采用分子标记辅助选择改良镇恢084的抗飞虱特性，以期为培育对飞虱具有综合抗性的杂交稻提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗飞虱品种镇籼232(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所培育)，对照IR36、IR26(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所保存)，镇恢084(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所培育)，感虫亲本TN1(引自扬州大学)、武育粳3号(常规粳稻品种)。

1.2 抗虫鉴定

供试材料抗飞虱特性鉴定采用徐红星等［7］方法，略有改动。2010年5月上旬将上述材料浸种、催芽后，播种于5 m ×1 m的水泥池内，用200目纱网罩住，每处理2行，F2群体10行，每行播种50粒，行距5 cm，用感虫品种武育粳3号播于试验区周围作保护行。待苗至二叶一心时，去除弱苗，定苗至每行30苗，按每苗5～7头稻飞虱接虫，重复3次。不施用任何对稻飞虱有影响的农药，保护行多施1次氮肥，以诱发稻飞虱发生。接种后统计每苗上的稻飞虱数量与类型。

由于徐红星等提出的抗性评价标准［7］较为粗放，在此基础上参照刘光杰等标准［8］予以细化:当感虫对照品种TN1死苗率达到95.0%时，根据死苗率评定抗性级别。评价标准为:死苗率≤1.0%，级别为 0，免疫;死苗率1.1% ～10.0%，级别为1，高抗;死苗率10.1% ～30.0%，级别为3，抗;死苗率 30.1% ～50.0%，级别为 5，中抗;死苗率50.1% ～70.0%，级别为7，中感;死苗率≥70.1%，级别为9，感。

1.3 分子标记检测

根据系谱分析与田间抗性鉴定的结果，参照Sun等［9］研究结果，获得与bph2紧密连锁的标记，对镇籼232的主效抗性基因进行检测和分子标记辅助选择。

1.4 DNA提取和PCR扩增、电泳检测

参考McCouch等［10］的方法提取水稻苗期叶片的DNA。PCR反应体系(总体积20.0 μl):10×Buffer(含 MgCl2)2.0 μl，10 mmol/L dNTPs 1.2 μl，1 μmol/L正、反向引物各 0.3 μl，5 U/ μl Taq 酶 0.2 μl，100 ng/μl DNA 模 板 1.0 μl，ddH2O 15.0 μl。扩增反应程序:94℃下预变性3 min;94℃下变性30 s，55～60℃下退火40 s，72℃下延伸1 min，循环35次;最后72℃下再延伸5 min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测读取结果后拍照或扫描保存。

2 结果

2.1 镇籼232的抗飞虱特性

通过田间采集飞虱，3种飞虱(褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱)分类饲养1至2代后分别以8头/丛稻株接种，在接种后第10 d飞虱种群进入高峰期，部分稻株飞虱数量逾百头，统计不同飞虱种群的数量发现褐飞虱占大多数，灰飞虱约占10.0%，白背飞虱占5.0%。表明，目前生产上前期主要还是褐飞虱危害，灰飞虱及白背飞虱危害较轻。

只含有Bph1基因的IR26中感褐飞虱，具有抗性基因bph2的IR36仍具有很高的抗性水平，鉴于2个基因对不同褐飞虱生物型的抗性特征，说明目前褐飞虱种群特性以生物型2为主，生物型1较少;镇籼232比IR36的抗性水平略高，镇恢084与IR26抗性相当，而武育粳3号高感飞虱。镇籼232/武育粳3号F1表现为抗，F2抗性分离，接近1/3植株死亡。这些结果说明镇籼232的抗飞虱特性受1对显性主效基因控制，同时还具有一些微效的抗性基因。

2.2 镇籼232的抗褐飞虱主效基因的来源及其验证

分析镇籼232的系谱可以发现，镇籼232的双亲为湘早灿3号(含IR36血统)及IR54，因此镇灿232可能携带了双系的抗性主基因bph2，并且聚合了双亲的微效主基因。用IR36、镇籼232、武育粳3号、TN1进行验证，发现镇籼232与IR36有一致的谱带。综合以上结果说明镇籼232含有抗褐飞虱主效基因bph2。

2.3 镇籼232的育种利用

2009年正季利用配合力好的优良恢复系镇恢084(含有Bph1基因)为母本，镇籼232为父本杂交，2009冬在海南种植F1，并混收F2种子。2010年正季种植F2群体，根据田间综合农艺性状选择37个优良单株，提取选择单株的DNA，利用标记RM463、RM7102进行检测筛选，淘汰不含bph2基因的单株，保留含bph2基因(包括杂合型)的单株21个。2010年冬海南加代种植F3株系，根据田间综合农艺性状结合分子标记辅助选择获得7个含bph2基因单株，中选单株于2011年正季在句容种成F4小区，每个小区种植100株。苗期去除病苗，采用徐红星等［7］方法田间鉴定当选群体的抗性水平。

结果显示，虽然田间鉴定受到一定的环境影响导致抗性水平略有差异，在经过多代分子标记辅助选择结合田间选择之后，目标单株的抗飞虱特性仍能保留，说明采用bph2两端的连锁标记选择有效，可大大减少重复鉴定的时间及精力。

3 讨论

常规育种手段根据田间表型选择后代，难以将多个有利的目标基因聚合到同一个体，并使这些基因在后代中稳定传递、不丢失。在找到与抗病虫基因紧密连锁或共分离分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection)技术可有效地选择抗虫有利基因和QTL的聚合，排除环境因素的干扰，提高选择的精确性，并可大大减少田间鉴定的工作量。之前在水稻抗病基因聚合育种研究方面已有很多报道:潘学彪等［11］通过分子标记辅助选择将来自镇稻88的抗条纹叶枯病基因Stv-bi导入优质食味品种武育粳3号，选育出新的抗性品种武陵粳1号;Jiang等［12］聚合Xa21和Bt基因到恢复系明恢63中;倪大虎等［13］利用分子标记辅助选择将广谱高抗稻瘟病的Pi9基因和高抗白叶枯病的Xa21基因聚合到优良品系中，获得了含双抗基因的一批优良新品系。

迄今已精细定位了多个抗褐飞虱基因，少数基因已成功克隆，这些研究结果为水稻分子标记辅助选择具有持久抗飞虱特性的品种提供了理论基础和实践支撑。然而，截止到目前，对水稻抗褐飞虱的分子育种大多处于理论研究阶段［14-15］，对灰飞虱及白背飞虱的抗性育种研究尚处于空白阶段。原因可能是由于稻飞虱种群较多，年份间差异较大，水稻抗飞虱鉴定易受环境和其他外界因素影响，无论是苗期、分蘖期、成熟期鉴定水稻的抗飞虱能力，都需要比较高的试验条件，需要投入较多的人力、精力，而实际工作中往往较难满足。另外，目前鉴定的抗源多数为野生稻或籼型原始材料，综合农艺性状、配合力较差，且单个基因的抗性效果不佳，应用价值不高。因此，直接从推广品种中挖掘抗性水平高的资源，分析其抗性基因，再借助分子生物学手段将其中的抗性基因导入当前主栽品种，可以缩短育种年限，提高有利基因的利用效率。本研究发现水稻品种镇籼232高抗褐飞虱，对白背飞虱也具有一定抗性，进一步通过系谱分析、抗性鉴定、分子标记检测等发现该品种含有抗褐飞虱基因bph2。选择含有抗褐飞虱基因Bph1的优良恢复系镇恢084为受体，通过1次杂交，将bph2导入镇恢084，分子标记辅助选择结合田间综合农艺性状的选择，采用接近生产的抗性鉴定方法，在简化操作的同时获得了高抗稻飞虱的聚合材料，为改良杂交水稻的抗飞虱特性提供了有价值的中间材料。

致谢: 本试验得到扬州大学农学院李荣德同学及扬州大学植物保护学院石兆鹏同学的无私帮助，再此深表感谢!

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