草莓品种宁玉再生体系的建立

凤 婷， 赵密珍， 王 钰， 夏 瑾， 孟宪凤

(1.安徽大学资源与环境工程学院，安徽 合肥 230601;2.江苏省农业科学院园艺研究所，江苏 南京 210014)

草莓品种宁玉是江苏省农业科学院园艺研究所选育，于2010年通过江苏省品种委员会鉴定的新品种，该品种早熟，果实圆锥形、果型端正、色泽艳丽、风味甜香，植株抗病性强、耐低温性好，为优良的设施栽培专用新品种［1］。针对这样的优良品种，如果能建立其再生体系，可以为今后进一步利用与研究奠定基础［2-3］。

由于草莓叶片、叶柄取材方便，便于携带和保存，早在20世纪80年代国外学者就开展了草莓叶片再生［4-5］的研究，中国很多研究者［6］也均通过试验建立了不同品种草莓叶片及叶柄再生体系［7-9］，均发现不同品种再生效率差距很大［10-11］。为此，本试验研究不同因素对宁玉再生的影响，旨在为宁玉再生体系的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

宁玉为江苏省农业科学院园艺所组培室培养的组培苗，选取转接45 d左右的健壮植株，扯下由内而外第3～7片幼嫩翠绿完全舒展开的叶龄在10～40 d左右的叶片，同时剪下所选叶片的叶柄，一起作为试验材料。

1.2 不定芽的诱导

1.2.1 激素组合的选择 将基本培养基定为MS(蔗糖30.0 g/L，琼脂6.2 g/L)+TDZ(2.0 mg/L)，在基本培养基上添加不同浓度的吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IAA)3种生长素，以基本培养基为对照，共10个组合。基本培养基与 IBA组合:IBA浓度分别为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。基本培养基与NAA组合:NAA浓度分别为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。基本培养基与IAA组合:IAA 浓度分别为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。

将生长状态一致的叶片剪成边长约4 mm左右的正方形，接入培养基中，30 d后统计试验结果。

1.2.2 再生部位的比较 将生长状态一致的叶片剪成边长约4 mm左右的正方形，叶柄剪成长约1 cm左右的条状，中间用手术刀片切割3～4道伤口(不能切断)，将叶柄和叶片一起放进MS培养基中培养，外面一圈叶片，里面一圈叶柄，可以直观的比较叶片和叶柄的诱导能力。每隔10 d观察试验结果，30 d后统计数据。

1.2.3 暗培养时间的筛选 将接种后的叶片和叶柄放进组培室黑箱中进行5 d、10 d、15 d、20 d的暗培养，直接光培养的作为空白对照。暗培养结束后放到正常光下培养，接种后30 d统计不同暗培养时间处理的诱导结果。

1.2.4 叶龄的筛选 分别选取叶龄为10 d、20 d、30 d、40 d左右的叶片做为材料，同上剪切后正面朝上放进同一瓶MS培养基中培养，接种30 d后比较不同叶龄叶片的诱导结果。

1.2.5 放置方式的比较 选取最佳诱导叶龄的叶片剪切后以不同方式(一半叶片剪切后正面向上接到外一圈，另一半剪切后反面向上接到内一圈)放进同一瓶培养基，接种30 d后观察叶片不同放置方式对芽诱导的影响。

1.2.6 培养条件与统计方法 本试验各处理均接种10瓶，每瓶10个叶片(柄)，重复3次，放到组培室［光照度3 000 lx，光照14 h/d，温度(25±2)℃］进行恒温培养。30 d后统计不定芽的诱导率。

叶片不定芽诱导率=长出不定芽的叶片总数/接种的叶片总数×100%;

叶柄不定芽诱导率=长出不定芽的叶柄总数/接种的叶柄总数×100%。

1.3 生根及移栽

将上述试验中的再生芽做生根培养的试验材料。

第一步:基本培养基的选取。配MS、1/2MS、1/4MS培养基。将再生芽剪下接种，进行生根培养，25 d后统计生根率、平均每株生根条数及根须长度，选出生根最佳基本培养基。

第二步:将第一步筛选出的培养基定为基本培养基，进行添加激素试验，探索最佳生根培养基的最佳激素组合。选取IBA、NAA以及IAA 3种生长素分别与基本培养基进行不同量组合，以基本培养基为对照，共10个组合。基本培养基与IBA组合:IBA浓度分别为 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。基本培养基与 NAA组合:NAA浓度分别为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。基本培养基与IAA组合:IAA浓度分别为 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。

将各组合调pH到5.8，放到组培室［光照度3 000 lx，光照14 h/d，温度(25±2)℃］进行恒温培养。每个处理接种5瓶，每瓶接种10株再生芽，重复3次。30 d后统计生根情况。

再生苗根部生长至4 cm左右时开启封口膜，往瓶内注入2 ml自来水后于室温下炼苗1 d。然后用镊子夹出于自来水龙头下洗净粘附的培养基，去掉外面一层老叶整理干净后栽到36格的营养钵中，将水浇透基质，放进大棚，以后1 d浇1次水保持基质充分湿润，14 d后统计成活率。

2 结果

2.1 不同激素组合的诱导效果

从不同激素组合诱导的结果显示:在IBA、NAA、IAA 3种激素中，NAA的诱导效果最好，另外2种激素的诱导效果无明显差异;对于同一种激素来说，激素添加量过少，诱导效率较低，但是添加量过高，诱导率增加不明显，玻璃化苗的机率大大增加。综合各结果:添加0.2 mg/L NAA的培养基诱导效果最好。

2.2 再生部位

从试验结果可以看出，叶柄出芽时间早于叶片，其诱导率高于叶片，说明叶柄再生能力强于叶片。从伤口的愈伤情况可以看出叶片和叶柄的基部诱导能力均高于叶顶部，诱导能力从强到弱依次为叶柄基部＞叶片基部＞叶片顶部＞叶柄顶部。

2.3 暗培养时间

从几种不同暗培养时间的外植体生长情况来看，10 d是最佳的暗培养时间，外植体诱导率达到50%。0 d、5 d的暗培养时间过短，叶片几乎不分化而且直接褐化枯萎，诱导率为零;15 d、20 d暗培养时间太长，诱导率不高，分别为24%和17%。

2.4 叶龄

从试验过程和结果来看，叶龄太小，不仅操作麻烦，难以修剪，而且分化率低，10 d大小的叶片叶面积太小，剪切不利，没有分化。30 d叶龄叶片诱导率只有12%，40 d叶龄叶片诱导率不高，在10%以下。20 d叶龄的叶片分化效果最佳，为46%。由此可见，叶龄过小、过大都不利于诱导，20 d叶龄大小合适，诱导活力最强，这可能与20 d时叶片中的激素水平适中有关。

2.5 放置方式

通过比较叶片的2种放置方式得出，正面朝上的放置方式诱导率达到52%，反面朝上放置方式的诱导率只有31%，这与很多文献所得出的结果基本一致。很多学者认为原因是叶片下表面气孔较多，与培养基接触容易从培养基中吸收更多的营养物质，所以正面朝上比较容易诱导再生。

2.6 生根培养基

试验结果发现:1/4MS培养基中再生芽最早生根，14 d时根须多而且长，平均每株生4～8条根须;MS培养基中生长的根系较粗壮，但是伸长速度较慢;1/2MS培养基中再生芽的生根速度及根须数皆不如1/4MS培养基。1/4MS培养基中组培苗株高不如MS培养基，但是移栽后发现1/4MS培养基的组培苗长势和MS培养基无显著差异，估计是生根后期营养的缺失导致。综合各因素，选取1/4MS培养基为最佳生根基本培养基。

在上述选取的最佳基本培养基基础上，进行添加激素试验，25 d后统计分析结果得出:生根率均可达到100%;但是IAA添加浓度为0.2 mg/L时生根较早，同时，在添加IAA培养基中，植株的根长、株高均优于添加IBA培养基;添加NAA的培养基，生根数量较多，植株高，但是极易长出白色瘤状物质，综合以上结果得出:生根培养基成分可确定为:1/4MS+IAA(0.2 mg/L)。

2.7 移栽后成活率

移栽14 d后观察发现大部分再生苗植株长高，叶片长大、增多，情况良好，成活率达到97.22%。添加IAA组合再生苗移栽后长势最好，添加NAA组合死苗很多，添加IBA组合草莓苗瘦弱矮小，长势不佳。

3 讨论

综合本试验结果可得出:草莓品种宁玉不定芽再生最佳培养基是 MS(蔗糖 30 g/L，琼脂 6.2 g/L)+TDZ(2.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L);叶片及叶柄基部诱导能力最强;10 d左右是暗培养最佳时间;20 d叶龄的叶片是最佳诱导材料;叶片正面朝上比反面朝上放置方式好;最佳生根培养基为1/4MS+IAA(0.2 mg/L);生根率可达到100%;炼苗移栽后成活率可达到97.22%。

本试验利用TDZ激素诱导再生，虽然再生率不低，但是有文献曾报道:TDZ的过度使用会增加产生玻璃化苗的风险，该试验过程中确实有小部分玻璃化苗出现，所以后续工作剔除玻璃化苗是关键步骤。

将叶片和叶柄一同培养可发现叶柄诱导芽的能力比叶片强，这与很多参考文献中提到的叶片诱导能力较强，叶柄比叶片容易诱导出愈伤组织，但不易直接诱导出芽［12］的结果不一致，这可能是基因型不同造成的，具体原因还需进一步探讨。本试验结果也表明叶柄和叶片基部诱导能力均强于顶部。

有很多研究结果表明，在IBA，NAA，IAA 3种生长素中，IBA诱导再生能力比NAA强［13］，而在本试验结果中，诱导能力最强的是NAA，IAA较弱，最差的是IBA，其具体原因有待进一步研究。

一些研究结果表明:再生过程中，暗培养后放到光下培养，如果外植体褐化无绿色而且无膨大现象，基本可以肯定是诱导失败。但本试验品种宁玉在诱导过程中，出现上述现象后，仍然具有很强的再生活力。由此可以证明该品种确实是抗性很强的优良品种，具体原因需以后从分子学层面深入探讨。

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